РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК БАКТЕРИЙ, КОЛОНИЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО



На правах рукописи

ДЕГТЯРЕВА ЛИДИЯ АНДРЕЕВНА

«РАЗРАБОТКА МЕТОДА ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ПЕРИНАТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ДНК БАКТЕРИЙ, КОЛОНИЗИРУЮЩИХ ОРГАНИЗМ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО»

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор  Кафарская Л.И.

кандидат медицинских наук    Шкопоров А.Н.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор  Сухоруков В. С.

доктор медицинских наук, профессор  Афанасьев С.С.

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «31» мая 2010г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.08 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

С авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «30» апреля 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор     Рылова А.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Одной из наиболее актуальных и сложных проблем в современной перинатологии являются инфекционные заболевания (Самсыгина Г.А., 1985; Флеминг П. и соавт., 1993; Гельфанд Б.Р. и соавт., 2006). Ключевыми бактериальными патогенами, вызывающими неонатальные инфекции являютсяEscherichia coli,Klebsiella spp.,Streptococcusagalactiae,Staphylococcus aureus,Streptococcus pyogenesиLysteriamonocytogenes. (AngusD.C.etal, 2001; Антонов А.Г. и соавт., 2005).

Успешное разрешение проблемы перинатальных инфекций, как в их предупреждении, так и в патогенетически оправданном и своевременном лечении зависит от использования эффективных диагностических и лечебных технологий. В связи с чрезвычайно высокой скоростью развития инфекционного процесса у новорожденного ребенка, особую значимость в неонатальной клинике приобретают методы микробиологической экспресс-диагностики. В настоящее время спектр диагностических возможностей для выявления перинатальных инфекций значительно расширился. В частности, в существующих программах по раннему выявлению инфекций у новорожденных, большое значение придается серологической диагностике, прежде всего для выявления вирусных инфекций (Гриноу А. и соавт.,2000).

В то же время существующие методы не всегда оказываются достаточно чувствительными для выявления патогенных микроорганизмов. В большей степени это относится к бактериальным патогенам, для обнаружения которых в основном используются традиционные микробиологические методы, характеризующиеся длительным временем получения результата, высокой трудоемкостью и высокой зависимостью интерпретации результатов от квалификации лабораторного персонала (Барашнев Ю.И., 2001).

В связи с этим в последние годы отдается предпочтение методам, основанным на эффектах ДНК-гибридизации и амплификации нуклеиновых кислот. Прежде всего, речь идет о методах, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР). Эти методы отличаются высокой чувствительностью и специфичностью, позволяют обнаруживать присутствие микроорганизмов в микроколичествах исследуемого материала  за короткое время (Виноградская Г.Р. и соавт., 1991; Ведяков А.М. и соавт., 1998;FowlieP.W.,SchmidtB., 1998). В качестве объекта исследования может быть использован любой биологический материал. Современные модификации этого метода, в первую очередь мультипраймерная ПЦР в режиме реального времени, позволяют проводить не только одновременное качественное определение присутствия нескольких патогенных микроорганизмов в исследуемом материале, но и устанавливать их количественное содержание (CarvalhoG.S.etal, 2007).

В настоящее время в России не представлено ни одной тест-системы для одновременного определения методом мультипраймерной ПЦР в режиме реального времени бактерийS. agalactiae, E. coli, Klebsiellaspp., являющихся основными патогенами в неонатологической практике. Разработка и внедрение в практику подобной тест-системы позволит существенно сократить время постановки диагноза новорожденных и назначения этиотропной антибактериальной терапии в отделениях интенсивной терапии и реанимации.

Цель исследования:

Разработать диагностическую тест-систему, обеспечивающую одновременную экспресс-диагностику инфекционных заболеваний, вызванныхStreptococcus agalactiae, Escherichia coliи Klebsiellaspp., у плодов и новорожденных детей, путем количественной детекции геномной ДНК указанных возбудителей методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Задачи исследования:

  1. Подобрать нуклеотидные последовательности праймеров и флуоресцентных зондов для детекцииS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.
  2. Сравнить эффективность различных методов выделения ДНК из бактериальных культурS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp. Выбрать наиболее адекватный метод, пригодный для выделения ДНК из различных видов клинического материала.
  3. Создать систему калибровочных образцов ДНК и ДНК внутреннего контроля для использования в создаваемой мультипраймерной тест-системе.
  4. Оптимизировать условия протекания ПЦР-РВ для детекцииS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp, включая подбор оптимальной  концентрации компонентов реакции  и температурных режимов  ее проведения.
  5. Оценить чувствительность, специфичность и достоверность качественной и количественной детекции ДНКS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.с использованиемполученной мультипраймерной тест-системы.

Научная новизна исследования.

В ходе исследования была создана мультипраймерная тест-система позволяющая проводить одновременную детекцию методом ПЦР-РВ трех основных возбудителей неонатальных инфекций. Был произведен дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов комплементарных фрагментам геновuidAE.coli,cfbS.agalactiae,консервативному участку 16S рибосомальной РНКKlebsiellaspp.,а также проверена специфичность и чувствительность этих праймеров на коллекции лабораторных штаммов и клинических образцах. Кроме того был предложена модификация метода выделения геномной ДНК улучшающая выход геномной ДНК, выделяемой из бактерий родаStreptococcus.

Практическая значимость работы.

Применение разработанной тест-системы должно обеспечить раннее, в том числе доклиническое, выявление наиболее значимых перинатальных инфекций; широкий спектр дифференциально-диагностических возможностей при сходстве клинической картины заболевания у новорожденных; количественную оценку бактериальной обсемененности исследуемого материала, а также высокую чувствительность и специфичность.

Внедрение результатов работы в практику.

В настоящее время полученная тест-система используется в научно-исследовательской работе кафедр микробиологии и вирусологии,  клинической лабораторной диагностики, а также кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

  1. В ходе исследования была разработана мультипраймерная тест-система для выявления ДНКE.coli,S.agalactiae,Klebsiellaspp. в образцах клинического материала методом ПЦР-РВ
  2. Протокол выделения бактериальной ДНК из клинического материала, разработанный в ходе настоящего исследования, существенно повышает эффективность экстракции ДНК из бактерий родаStreptococcus.
  3. Полученная диагностическая тест система характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью детекции ДНК трех основных возбудителей неонатальных инфекций в различных видах клинического материала.

Апробация работы.

Основные положения работы были доложены на заседании научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава и кафедры неонатологии ФУВ ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, протокол №1 от 25 февраля 2010 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых ВАК научных журналах.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на русском языке, на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 180 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 рисунками и 9 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы.

С целью решения поставленных задач нами был проведен дизайн олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных зондов. Нуклеотидные последовательности генов-мишеней для ПЦР были получены из баз данных NCBI GenBank и Ribosomal Database Project II. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием сетевой программы ClustalW.

Дизайн олигонуклеотидов для использования в качестве праймеров зондов Taqman осуществлялся с использованием приложения PerlPrimer. Уникальность ПЦР-праймеров проверялась посредством поиска их последовательностей в базе данныхGenBank при помощи алгоритмаBlastN. Олигонуклеотиды были синтезированы амидофосфитным методом и очищены при помощи препаративного электрофореза в ПААГ. Зонды Taqman на этапе синтеза были конъюгированы с флуоресцентными красителями на 5'-концах(FAM, R6G, ROX, Cy5), а также с тушителями флуоресценции (RTQ1 либо RTQ2) на 3'-концах или по внутреннему остатку тимина (зонд cfb-TP1). В случае зонда cfb-TP1 3'-концевая гидроксильная группа была блокирована сложноэфирной связью с остатком фосфорной кислоты.

Таблица 1. Олигонуклеотидные праймеры и зондыTaqman, использованные в ходе исследования.

Постановку реакций мультиплекс-ПЦР в режиме реального времени осуществляли с использованием смеси 4 пар праймеров, 4 зондов и 2,5Х реакционной смеси, содержащейTaq-полимеразу с горячим стартом (Pfaffl,M.W., 2001). Для проведения ПЦР использовали стандартную двухфазную температурную программу: первоначальная денатурация 95оС 5 мин, денатурация 94оС 15 с, отжиг и элонгация 60оС 60 с. Длительность программы составляла 40 циклов.

Для получения калибраторных плазмидных ДНК ПЦР-продукты, полученные при помощи мультиплексной ПЦР, были клонированы в вектор pTRKH2. Клонирующий векторpTRKH2 расщепляли рестриктазойSmaI и лигировали с очищенными вставочными ДНК. Скрининг рекомбинантных плазмид проводили при помощи теста на экспрессию β-галактозидазы. Трансформацию штаммов кишечной палочки проводили при помощи электропорации (ManiatisT., 1982). Плазмиды из трансформированных клонов бактерий выделяли при помощи общепринятых методов. В качестве ДНК внутреннего контроля была получена рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент генаGFPAequorea victoria

Геномную ДНК из образцов бактериальных культур и клинического материала выделяли с использованием модифицированного метода Бума (Boom et al., 1990) с предварительным разрушением клеточных стенок бактерий путем последовательной обработки лизоцимом и протеиназой К в буфере оптимального состава. Помимо этого было проведено изучение влияния предварительной обработки лизоцимом и протеиназой К вместе и по отдельности на эффективность выделения геномной ДНК из клетокS. agalactiae иKlebsiella pneumoniae и сравнение с методами выделения ДНК использованными в коммерчески доступных наборах «Экстраген», «Реамикс» (Гентех, Россия) и «Рибосорб» (Интерлабсервис, Россия) в соответствии с рекомендациями изготовителя.

Специфичность разработанной тест системы изучали с использованием препаратов ДНК, выделенных из 45 штаммов бактерий различных видов.

Для определения достоверности количественной детекции ДНК,  эффективности протекания ПЦР-реакций и аналитической чувствительности  разработанной мультипраймерной тест-системы были проведены серии реакций с использованием в качестве матрицы серийных десятикратных разведений смеси геномных ДНК выделенных из культурE. coliBA5,K.pneumoniae EK1иS.agalactiaeN4, находившихся в экспоненциальной фазе роста. Достоверность количественной детекции определяли путем построения калибровочных кривых и определения коэффициентов корреляции. Эффективность амплификации рассчитывали на основании крутизны калибровочной прямой построенной через экспериментальные точки в полулогарифмической системе координат.

Для изучения диагностической специфичности и чувствительности разработанной тест-системы для мультипраймерной ПЦР-РВ было проведено ее тестирование на препаратах ДНК, выделенных из 117 клинических образцов. Из них 103 клинических образца были получены от новорожденных детей, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии, 14 были симулированы в лаборатории, путем добавления чистых культур бактерий различных видов к различным биологическим жидкостям, взятым у здоровых взрослых добровольцев. Исследование 14 симулированных клинических образцов проводилось слепым методом в количественном и качественном варианте. В этом случае непосредственный исполнитель не был информирован, в каких образцах содержались культурыS.agalactiae,E.coli иKlebsiellaspp., а какие содержали культуры других видов.

Использованные в работе штаммы бактерий культивировали на элективных питательных средах, с учетом их физиологических особенностей. Для определения количества жизнеспособных бактерий в культурах, находящихся в экспоненциальной фазе роста, использовали метод посева серийных десятикратных разведений на плотную питательную среду BHI с последующим подсчетом числа колоний. Бактериологический посев клинического материала и идентификация возбудителей проводились с использованием стандартных методов (MurrayP.R.etal, 2003).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием общепринятых статистических методов на персональном компьютере с применением программы «MicrosoftExcel». Для проведения статистического анализа полученные результаты представляли lg колониеобразующих единиц или геном-эквивалентов бактерий на 1 мл исследуемого материала. Для каждой таксономической группы микроорганизмов рассчитывали частоту встречаемости, среднее значение и стандартное отклонение концентрации. Для выявления связи между данными, полученными бактериологическим методом и ПЦР-РВ с использованием мультиплекс-системы, проводился корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции R2, а также анализ таблиц сопряженности с использованием критерия χ2.(Гланц С.,1998).

Результаты собственных исследований.

  1. Дизайн праймеров и олигонуклеотидных зондов.

В качестве генов мишеней для разработки диагностической тест-системы для детекции патогеновE. coliиS.agalactiae были избраны геныuidAиcfb соответственно. ГенuidA кодирует синтез фермента β-глюкуронидазы, а генcfb отвечает за образованиеCAMP-фактора у стрептококков группы В, биологическая активность которого заключается в расширении зоны гемолиза, вызванного β-гемолизином золотистого стафилококка.

ГенuidA кишечной палочки, а также генcfb стрептококковStreptococcusagalactiae представляют собой уникальные для данных видов гены, не встречающиеся у эволюционно родственных видов и родов микроорганизмов и не имеющие близких гомологов в геномах бактерий других родов

В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей 10 штаммовE. coliи 10S.agalactiae было выявлено несколько протяженных районов 100%-ной идентичности нуклеотидной последовательности между всеми штаммами, которые и были избраны в качестве мишеней для отжига праймеров и проб (Таблица 1).

В настоящее время у бактерий родаKlebsiella не описаны уникальные гены, характерные строго для этого рода. В этой связи задача создания родоспецифичной тест-системы для детекции бактерийKlebsiellaspp. решалась путем поиска консервативных районов в гене 16S-рРНК, отличающихся у бактерий родаKlebsiellaот последовательностей бактерий других родов семействаEnterobacteriaceae.

В результате выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S-рРНК (rrn) 3 штаммовK. pneumoniaeи 3 штаммовK.oxytoca с соответствующими нуклеотидными последовательностями из 20 штаммов различных видов бактерий был обнаружен ряд районов с выраженной родовой специфичностью в отношенииKlebsiella spp.Один из таких участков был выбран в качестве мишени для разработки родоспецифичных диагностических ПЦР-праймеров и зонда для детекции патогенов родаKlebsiella(Рис. 1). Дизайн праймеров, комплементарных данному участку осуществлялся таким образом, чтобы 3’-терминальные и/или субтерминальные нуклеотидные остатки были комплементарны родоспецифичным остаткам в последовательностях 16S-рРНК.

Для создания внутреннего контроля качества выделения ДНК и протекания ПЦР была создана пара праймеров и зонд, комплементарные фрагменту генаGFP.

Рис. 1.Выравнивание нуклеотидных последовательностей генов16S-рРНК бактерий семействаEnterobacteriaceae в районе отжига родоспецифичных праймеров и зонда для детекцииKlebsiella spp.

  1. Оценка специфичности, аналитической чувствительности тест-системы, а также достоверности количественной детекции ДНК.

В результате тестирования полученной мультипраймерной тест-системы на препаратах ДНК, выделенных из 45 штаммов бактерий разных видов  было показано, что накопление флуоресцентного сигнала на соответствующих каналах происходило лишь при использовании в качестве матриц ДНК, выделенных из бактерийE. coli, S. agalactiae, K. pneumoniae, K. oxytoca. Постановка ПЦР с бактериями других видов, в т.ч. эволюционно близких (Citrobacter sp., Enterobacter sp., Proteus sp., Streptococcus anginosus, S. lactis, S. pyogenes, Enterococcus sp.) давала отрицательный результат.

При анализе достоверности количественной детекции ДНК была выявлена высокая эффективность амплификации (E = 2; 2; 1,81; 1,91 дляuidA, cfb, rrn иGFP соответственно) и сильная корреляционная связь ( R2 = 1; 1; 0,99; 0,99 дляuidA, cfb, rrn иGFP соответственно) концентрации калибровочных образцов ДНК и определяемого значения порогового цикла (Рис. 2). Аналитическая чувствительность полученной тест системы была не ниже 300 геном экв. для детекции геновuidA, cfb, rrn.

Рис. 2.Определение достоверности количественной детекции ДНК и эффективности протекания ПЦР-реакций в разработанной мультипраймерной тест-системе. А – праймеры специфичные кS. agalactiae, Б – праймеры специфичные кKlebsiella spp., В – праймеры специфичные кGFP.

  1. Получение рекомбинантных плазмидных ДНК для использования в качестве калибраторов и внутреннего контроля ПЦР

В качестве ДНК положительного контроля, калибраторных образцов и ДНК внутреннего контроля в настоящей работе были созданы рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие клонированные фрагменты генов-мишеней для ПЦР. Полученные плазмиды были использованы для создания серии растворов смесей калибраторных ДНК и ДНК внутреннего контроля, соответствующих по концентрации 3х107 3х106 3х105 3х104 и 3х103 копий/мл целевых генов (cfb,uidA,rrn иgfp).

Рис. 3.Структура челночного клонирующего вектораpTRKH2.lacZ’ - α-фрагмент генаβ-галактозидазыE.coli;EmR – ген резистентности к эритромицину;orip15A иoripAMβ – ориджины репликации активные в кишечной палочке и грамположительных бактериях соответственно.

  1. Сравнение различных методов выделения ДНК

В результате сравнения различных методов выделения геномной ДНК из штаммов бактерийS.agalactiae иK.pneumoniae нами было показано, что, несмотря на хороший выход при выделении ДНК из культурыK.pneumoniaec использованием наборов «Экстраген», «Реамикс» и «Рибосорб», данные комплекты реактивов оказались абсолютно неэффективны для выделения ДНК из культурыS.agalactiae. Это обусловлено резистентностью массивной клеточной стенки грамположительных бактерий к лизису хаотропными солями и детергентами. Наилучшие результаты как дляS.agalactiae, так и дляK.pneumoniae были продемонстрированы при использовании предложенной нами комбинации метода Бума с предварительным разрушением клеточной стенки бактерий гидролитическими ферментами (Рис. 4).

Рис. 4. Сравнение различных методов выделения ДНК из культурK.pneumonia иS.agalactiae.Дорожки 1-5: выделение геномной ДНК из культурыK.pneumoniae. Дорожки 6-10 выделение геномной ДНК из культурыS.agalactiae.  Дорожки 1 и 6 – метод Бума в сочетании с обработкой протеиназой К и лизоцимом; 2 и 7 – метод Бума в сочетании с обработкой лизоцимом; 3 и 8 – метод Бума в сочетании с обработкой протеиназой К; 4 и 9 – базовая процедура метода Бума; 5 и 10 – набор Ускоренная пробоподготовка.

На основе полученных данных об эффективности выделения ДНК различными методами был создан лабораторный образец диагностической тест системы, включающий в себя следующие компоненты:

1) Буфер для выделения ДНК 2Х, (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2мМ ЭДТА, 10 мг/мл лизоцим, 5нг/мл ДНК внутреннего контроля); 2) Раствор протеиназы К 20 мг/мл; 3) Лизирующий буфер (6M гуанидин изотиоцианат, 20mM ЭДТА, 40 г/л Triton X-100 and 10 г/л DTT); 4) микроколонки со стекловолоконными мембранами; 5) Отмывочный буфер (50mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.5, 2.5 mM ЭДТА 50% этанол); 6) Элюирующий буфер (10мМ Tris-HCl pH 8.0, 1мМ ЭДТА); 7) Реакционная смесь 2,5Х; 8) Смесь праймеров и зондов 5Х; 9) Растворы калибраторных плазмидных ДНК (6 шт.); 10) Форма расчета результатов для пакета Microsoft Excel (компакт-диск); 11) Инструкция по применению тест-ситемы.

5. Оценка диагностической чувствительности и специфичности разработанной тест системы

Диагностические характеристики разработанной тест-системы изучали в сравнении с классическим бактериологическим методом, подразумевающим выделение чистых культур бактерий из исследуемого материала с использованием элективных питательных среды и последующую морфологическую и биохимическую (либо серологическую) идентификацию выделенных культур. Всего было исследовано 117 клинических образцов, среди которых 103 клинических образца представляли собой материал (моча, стул, мазки из зева и ануса, аспират из трахеи, аспират из желудка), полученный от новорожденных, находящихся в отделении реанимации и интенсивной терапии, а 14 были симулированы в лаборатории путем добавления чистых культур определяемых возбудителей в образцы биологических жидкостей (слюна, моча, цельная кровь с консервантом ЭДТА), взятых у здоровых взрослых добровольцев.

При изучении слепым методом симулированных образцов данные по качественному и количественному присутствиюS.agalactiae,E.coli иKlebsiellaspp., полученные методом ПЦР-РВ с использованием разработанной мультипраймерной системы, полностью соответствовали результатам бактериологического исследования.

При изучении клинических образцов полученных из отделения реанимации новорожденных метод ПЦР-РВ проявил большую чувствительность по сравнению с классическим бактериологическим методом. Так, методом ПЦР-РВS.agalactiae,Klebsiellaspp.иE.coliбыли выявлены в 31 образце (30,09%), в то время как с использованием бактериологического метода бактериальную обсемененность выявляли в 29 образцах (28,1%).

При оценке частоты встречаемости трех детектируемых возбудителей в клиническом материале новорожденных было показано, что наиболее часто в образцах обнаруживались бактерии родаKlebsiella (19,38% случаев при бактериологическом исследовании и 15,3% при исследовании методом ПЦР-РВ). Более высокая частота выявления бактерий этого рода с использованием традиционного бактериологического метода может быть обусловлена ошибочной биохимической идентификацией некоторых штаммов, в действительности не относившихся к родуKlebsiella. Таким образом, без учета возможных ошибок в бактериологическом методе диагностическая чувствительность метода ПЦР-РВ по сравнению с посевом составила 77,3%, а диагностическая специфичность равнялась 98,8%. Частота детекцииE.coliв клинических образцахбыл несколько меньше, чем таковая дляKlebsiellaspp. и равнялась при использовании обоих методов диагностики 10,2%. Значения чувствительности и специфичности разработанного нами метода детекцииE. coli в сравнении с бактериологическим составили 100% и 98,9% соответственно. Бактерии видаS.agalactae не были выделены с помощью бактериологического метода ни в одном из клинических образцов. Возможно, это связано с назначение антибактериальной терапии новорожденным детям в первые часы жизни. Поэтому в образцах, полученных от детей отделения реанимации и интенсивной терапии, присутствовали либо погибшиеS.agalactae, либо их некультивируемые формы, ДНК которых и определялась методом ПЦР-РВ в 7,14% случаев. В этой связи показатели чувствительности и специфичности ПЦР-РВ для детекции стрептококков группы В по сравнению с бактериологическим методом составили 100% и 93% соответственно (Рис. 5).

Рис. 5. Частота встречаемости возбудителей в клинических образцах, полученных от новорожденных отделения реанимации и интенсивной терапии, выявленная бактериологическим методом и методом ПЦР-РВ.

Изучение уровня бактериальной обсемененности различных видов клинического материала, полученного из отделения реанимации новорожденных выявило наиболее высокую обсемененность аспирата трахеи новорожденных. Из 21 образца аспирата из трахеи при бактериологическом исследовании в 9 случаях (42,9%) был выявлен ростаS.agalactiae,Klebsiellaspp.,E.coli в ходе бактериологического исследования. При использовании метода ПЦР-РВ положительный результат был отмечен в 10 образцах (48%). При исследовании 27 мазков из зева присутствие в материалеS.agalactiae,Klebsiellaspp.иE.coliотмечалось в 9 (33,3%) случаях при использовании бактериологического метода и в 11 случаях (40,8%) при применении ПЦР-РВ.

В мазках из ануса, аспирате из желудка и испражненияхS.agalactiae,Klebsiellaspp.иE.coli встречались реже. Из 41 образцов в 8 (19,5%) при бактериологическом исследовании и в 7 (17,07%) методом ПЦР-РВбыли выявленыKlebsiellaspp.иE.coli. В моче бактериологическим и ПЦР-РВ методами три основных возбудителя неонатальных инфекций были детектированы в 22% случаев. Желудочно-кишечный и мочеполовой тракты у новорожденных чаще остаются стерильными в первые дни жизни, поэтомуS.agalactiae,Klebsiellasp.,E.coliприсутствовали в материале из этих органов реже, чем в других.

Также было проведено сравнение количественной оценки обсемененности образцов бактериямиS.agalactiae,Klebsiellaspp.иE.coliпри использовании двух методов диагностики. Наибольшая концентрация среди детектируемых видов микроорганизмов в клинических образцах была характерна дляE.coli. Среднее значение ее для бактериологического метода составило 6,538lg КОЕ и 6,853lg геномэкв для метода ПЦР-РВ. Среднее значение концентрацииKlebsiellaspp определялось как 5,068lg КОЕ для бактериологического метода и как 5,701lg геномэкв для ПЦР-РВ. КонцентрацияS.agalactiae в клиническом материале была практически одинаковой с таковой дляKlebsiellaspp, ее среднее значение 5,254lg геномэкв. Таким образом, можно также судить о том, что концентрация микроорганизмов родовEscherichia иKlebsiella в клиническом материале, выявленная методом ПЦР-РВ с использованием разработанной диагностической системы была практически эквивалентна таковой при бактериологическом исследовании (Рис. 6).

Рис. 6. Сравнение концентрации возбудителей в клинических образцах, определенной методом ПЦР-РВ и бактериологическим методом.

Для сравнительного анализа качественной детекции возбудителей в исследуемом материале с использованием двух различных методов был проведен анализ таблиц сопряженности с использованием критерия  χ2. ЗначенияP составили 1,0  дляE.coli и 0,087 дляS.agalactiaeи 0,041дляKlebsiella spp, что свидетельствует об отсутствии различий в выявляемости обсемененности образцовE. coli с использованием обоих методов. В то же время, низкие значенияP дляS.agalactiaeиKlebsiella spp. свидетельствуют о статистически достоверной разнице в эффективности выявления данных возбудителей с использованием двух методов. Это может быть обусловлено ложноположительными результатами бактериологической детекцииKlebsiella spp., связанными с недостаточно точной биохимической идентификацией выделяемых чистых культур, а также ложноотрицательными результатами при бактериологической детекции стрептококков группы В.

Для сравнительного анализа количественных значений концентрации микроорганизмов в клиническом материале определяемых с использованием мультипраймерной ПЦР-РВ тест-системы и классического бактериологического метода были рассчитаны коэффициенты корреляции R2. Была выявлена сильная прямая корреляционная связь значений концентраций определенных с использованием двух методов. Коэффициент R2 составил: 0,9 дляS.agalactiae, 0,83 дляE.coli и 0,71 дляKlebsiellaspp(Рис. 7 и 8).

Рис 7. Корреляция значений концентрацииE.coli.в клинических образцах, определяемых с использованием мультипраймерной ПЦР-РВ (ось ординат) и бактериологического метода (ось абсцисс).

Рис 8. Корреляция значений концентрацииE.coli.в клинических образцах, определяемых с использованием мультипраймерной ПЦР-РВ (ось ординат) и бактериологического метода (ось абсцисс)

Выводы

  1. В ходе проведенного исследования были разработаны высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченных олигонуклеотидные зонды комплементарные фрагментам геновcfbS.agalactiae,uidAE.coliи консервативному участку 16S-рРНКKlebsiellaspp., позволяющие осуществлять детекцию ДНК указанных бактерий методом ПЦР в режиме реального времени.
  2. Разработанный в ходе исследования протокол экстракции геномной ДНК обеспечивает адекватное выделение ДНК из бактерийS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.
  3. Созданный лабораторный образец диагностической тест системы позволяет проводить достоверную количественную детекцию бактериальных патогеновS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.методом ПЦР-РВ в различных видах клинического материала.
  4. Полученная мультипраймерная тест-система характеризуется высокой диагностической чувствительностью и специфичностью, а также  достоверностью качественной и количественной детекции ДНКS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.
  5. Использование разработанной  мультипраймерной тест-системы  позволяет сократить время исследования до 150 минут.

Практические рекомендации

Разработанная в ходе проведенного исследования мультипраймерная диагностическая ПЦР-РВ тест-система после проведения дополнительных клинических испытаний и сертификации может быть использована в диагностике неонатальных бактериальных инфекций для обнаруженияS.agalactiae,E.coliиKlebsiellaspp.в различных видах клинического материала.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

  1. Володин Н.Н., Дегтярева Л.А., Кафарская Л.И., Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В., Шуникова М.Л., Чаплин А.Н., Ефимов Б.А.. Использование молекулярно-генетических технологий, основанных на ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний у новорожденных // Вопросы практической педиатрии. – 2010. - т. 5. - №3. - С.8-11.
  2. Дегтярева Л.А., Хохлова Е.В., Кулагина Е.В., Шкопоров А.Н.Разработка диагностической тест-системы для детекцииEscherichia coli,Klebsiella sp. иStreptococcusagalactia методом ПЦР-РВ // Инфекционные болезни.-2010. –т.8.- №2.- С.10-13
  3. Хромова С.С. Хамаганова И.В., Тарабрина Н.П., Дегтярева Л.А., Ахмедов Х.Б., Кафарская Л.И. Микробиологические и иммунные аспекты развития инфекций урогенитального тракта//Стерилизация и госпитальная инфекция. – 2009. - №.1. – С.14-18

Список сокращений

СГВ – стрептококк группы В

ВПГ - вирус простого герпеса;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты (дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ);

ИФА - иммуноферментный анализ;

НК – нуклеиновые кислоты;

ОТ – обратная транскриптаза;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ЦМВ – цитомегаловирус;

ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция

ДПРПО - дородовый преждевременный разрыв плодных оболочек

LAL -Limulusamebocytelysate

Название праймера (зонда)

Нуклеотидная последовательность

Температура плавления,0С

Размер ПЦР-продукта, п.н.

kleb-F1

GCCTTCGGGTTGTAAAGC

61,33

67

kleb-R1

gtcaatcgatraggttattaacctc

61,42

kleb-TP1

ROX-CTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGAT-RTQ2

71,08

cfb-F1

CAGTTGAATCCAAATGTTACGG

60,17

78

cfb-R1

TAATGCTGTTTGAAGTGCTG

59,05

cfb-TP1

R6G-CAACAAGTTGAT-(RTQ1)-CAAGAGATTGTAACATTACAAGCA-P

67,73

uidA-F2

CTCTTTAGGCATTGGTTTCG

59,2

82

uidA-R2

TTGCTGAGTTTCCCCGTT

61,77

uidA-TP2

FAM-CTTTCGGCTTGTTGCCCGCTT-RTQ1

69,04

GFP-F3

GTGAACTTCAAGATCCGCC

61,03

71

GFP-R3

GTGTTCTGCTGGTAGTGGT

61,82

GFP-TP1

Cy5-ATCGAGGACGGCAGCGTGCA-RTQ2

71,67




Похожие работы, которые могут быть Вам интерестны.

1. Разработка метода прогнозирования процесса старения изоляции на основе термофлуктуационной теории частичных разрядов

2. Отчет о производственной практике в ЗАО НПО Консультант. Разработка и внедрением АСУ Восточный экспресс

3. Применение экспертного метода при выборе измерительной аппаратуры для проведения специальной оценки условий труда

4. Профессиональный риск на основе специальной оценки условий труда

5. Совершенствование мотивационных процессов на основе оценки деятельности персонала в ПАО «Сбербанк»

6. Финансовый анализ как инструмент оценки конкурентоспособности компаний на основе публичной отчетности

7. Исследование проблемы оптимально управления в динамической односекторной экономической модели с дискретным временем и общими граничными условиями на основе метода динамического программирования

8. Разработка деревьев решений диагностики различных неисправностей авторефрижераторов

9. Разработка информационной системы диагностики отклонений в развитии у детей раннего возраста

10. Разработка содержания психологического сопровождения детей на этапе подготовки детей к школе