Влияние растворов сульфатов меди (II) и кадмия на удельную активность каталазы проростков амаранта сорта Крепыш и щирицы обыкновенной (запрокинутой)



ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Обязательным свойством любого, в том числе и растительного организма является способность к защите от повреждающих и неблагоприятных факторов среды. Ответные реакции, которые вызваны в организме внешними воздействиями, объединяют терминами "адаптационный синдром", а также не совсем точным, но при этом широко находившимся термином "стресс". В первый раз термин "стресс" в физиологию и психологию ввёл Уолтер Кэннон.

По Селье, стресс − это совокупность всех неспецифических изменений, которые возникают в организме под влиянием разных неблагоприятных и повреждающих факторов. Селье предполагал, что одной из главных отличительных характеристик живых организмов является способность адаптироваться к стрессорам путём "концентрирования усилий", или напряжения [23].

Внешние факторы называются стрессовыми, которые оказывают отрицательное воздействие на растение. Во многих случаях стрессовое воздействие оценивают по его влиянию на выживание растительного организма, процессы роста, ассимиляции углекислоты или элементов минерального питания. Различные виды растений устойчивы (или неустойчивы) к различным стрессовым воздействиям. Таким образом, характер стрессового воздействия зависит от вида растения и от стрессового фактора. Получение устойчивости под воздействием одного из неблагоприятных факторов способно вызывать увеличение устойчивости растительного организма к другим стрессовым воздействиям. Такое явление называется кросс - устойчивостью, или кросс - адаптацией.

По причине прикреплённому образу жизни растения довольно часто подвергаются стрессовым воздействиям. Такое требует комплексной и высокоупорядоченной системы ответных реакций на такие факторы как избыточная или недостаточная освещённость, жара, холод, гипоксия, засуха, повреждения. Растения способны достаточно быстро реагировать на сигналы, которые поступают из окружающей среды, и, адаптируясь к ним,  корректируют программу своего развития.

Растения в значительной мере подвергаются стрессовым воздействиям в естественных условиях. Существуют стрессовые факторы, например высокая или низкая температура воздуха, которые могут действовать в течение нескольких часов. Другие −оказывают на растение неблагоприятное влияние в течение нескольких дней, недель, или месяцев. В частности устойчивость к неблагоприятным условиям среды определяет характер распределения разных видов растений по климатическим зонам. Растения очень редко находятся в оптимальных ситуациях комплекса факторов внешней среды в естественных условиях произрастания, так как постоянно испытывают действие стрессовых факторов разной силы и продолжительности.

Одни действуют в течение короткого времени (порывы ветра, град), а другие — в течение многих дней (затопление, высокая или низкая температура), месяцев и даже лет (повышенная кислотность почвы, заболачивание и др.). При этом достаточно часто растения испытывают влияние комплекса неблагоприятных факторов. Примерами являются: одновременное влияние высокой температуры и дефицита влаги; избыточной влажности, недостатка кислорода и патогенных микроорганизмов.

Все факторы внешней среды, которые действуют на растения, разделяют на две основные группы: биотические и абиотические. Влияние биотических факторов определяется взаимодействием растений с другими живыми организмами. К таким относят возбудителей болезней и вредителей, повреждение травоядными животными, вытаптывание, симбиоз и паразитизм. К абиотические относят факторы неживой природы, такие как температура, свет, влажность, питательные вещества концентрация CO2и другие [21].

Цель − изучить влияние растворов сульфатов меди(II) и кадмия на удельную активность каталазы проростков амаранта сорта Крепыш и щирицы обыкновенной (запрокинутой).

Для достижения данной цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние растворов сульфатов меди(II) и кадмия на  удельную активность каталаз прорастающих семян амаранта.

2. Сравнить влияние стрессоров в зависимости от объектов исследования, концентрации растворов и продолжительности воздействия.

  1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

  1. Амарант

Амарант –это однолетнее растение, которое является семейством амарантовых. Примерами служат:крепыш, щирица, петушиные гребешки, бархатник, кошачий хвост.Растения способны достигать 2-3 м высоты, с толщиной стебля 8-10 см, массой от 3-5 до 30 кг. Соцветие – пышная метелка, длиной до 1,5 м различной плотности и формы. Семена мелкие, разной окраски. Всхожесть могут сохранять до 5 лет. Родиной амаранта является Центральная и Южная Америка. В мире существует 65 родов и около 900 видов амаранта. Всего в России известно 17 видов. Во многих странах мира амарант выращивают в качестве однолетнего овощного растения, которое дает нежную и обильную зелень. Также эта культура способна обеспечивать людей очень богатым урожаем семян. Одной из главных ценностей является амарантовое масло, в состав которого входит сквален С30 – терпеновый углеводород. Кроме использования в пищевых целях, амарант ценится в качестве лекарственного, декоративного и кормового растения. Наиболее распространенным считается амарант обыкновенный, который является сорняком, хотя и применяется как ценное кормовое растение. Амарант, в зависимости от вида, может быть окрашен в зеленый или пурпурно-красный цвет [5].

  1. Биохимический состав амаранта.

    Амарант формирует достаточно большую биомассу листьев, более того имеет исключительный биохимический состав и обладает очень высоким содержанием белка, полным набором незаменимых аминокислот, аскорбиновой кислоты, полифенолов, каротиноидов и других биологически активных добавок (БАД).

    Амарант относят к высокобелковым культурам. Общее содержание белков в семенах различных видов амаранта колеблется от 17,8 до 13,7% . У амаранта наиболее распространены четыре вида белков, основным из которых является альбумин.

    Общее число липидов в семенах амаранта колеблется от 2 до 17% в зависимости от вида.

    В достаточной степени изучен состав углеводов в семенах амаранта. Содержание в которых, способно достигать до 60% от массы семян. В их составе были выявлены в основном сахароза и рафиноза. В значительном количестве в семенах амаранта был обнаружен крахмал, который составляет 69%.

    В 1977 году были представлены результаты исследований флавоноидов в 54 видах амаранта. В результате из надземной части 16 видов амаранта были выявлены три вещества флавиновой природы – кверцетин, трифолин и рутин [7].

    1. Общие представления об устойчивости растений

    Способность растения переносить действие неблагоприятных факторов называется устойчивостью, то есть – это способность растений сохранять постоянство внутренней среды и осуществлять жизненный цикл в условиях действия стрессоров. Это понятие обширно используется в физиологии растений. Как правило, при этом требуется уточнение, в отношении какого фактора устойчиво растение. Можно говорить о жароустойчивости, холодоустойчивости, радиоустойчивости, устойчивости к осмотическому стрессу и т.д. Устойчивость растения испытывают путем его выдерживания в стрессовых условиях, когда напряженность фактора, по отношению к которому испытывается устойчивость, находится у пределов, переносимых организмом [9].

    Благодаря классификации устойчивости по отношению к внешним факторам, действующим на растение, говорят об устойчивости к химическим и физическим воздействиям. В некоторых случаях повреждение организма, которое сопровождается фактором физической природы, опосредуется химическими агентами, образующимися в растении при действии на него физического фактора. Например, действие на растение ионизирующей радиации, ультрафиолетовых лучей, высокой температуры связано с медиаторами химической природы. Устойчивость растения к стрессовому воздействию зависит от фазы онтогенеза. Наиболее устойчивы растения, находящиеся в покое в виде семян, луковиц. Наиболее чувствительны – растения в молодом возрасте, в период появления всходов. Далее по мере роста и развития устойчивость растений постепенно возрастает вплоть до созревания семян. Тем не менее, период формирования гамет также является критическим, так как растения в это время сверхчувствительны к стрессу и реагируют на действие стрессоров снижением продуктивности. Действию стрессовых факторов подвергаются дикорастущие растения, а так же и культурные. Любой экстремальный фактор проявляет отрицательное влияние на рост, накопление биомассы и урожай. Поэтому также иногда говорят об агрономической устойчивости. Такая устойчивость называется способностью у растений давать высокий урожай в неблагоприятных условиях. Степень снижения урожая под влиянием стрессовых условий является показателем устойчивости к ним растений.

    Изучая природу общих механизмов устойчивости к большой группе стрессоров, вызывающих водный дефицит, можно выделить три типа универсальных механизмов:

    1. стресс-индуцированное новообразование макромолекул с защитными свойствами;

    2. синтез совместимых осмолитов с множественными протекторными свойствами;

    3. функционирование антиоксидантных систем.

    Особую роль в устойчивости растений к действию стрессоров играет адаптация (от лат. аdaptatio – приспособление). Понятия адаптация и устойчивость тесно связаны между собой. Тема адаптации – одна из центральных в биологии. В литературе по вопросам адаптации зачастую обсуждаются высокоспециализированные приспособления на физиологическом, морфологическом, поведенческом и других уровнях. Адаптация показывает, с одной стороны, устойчивость биологических систем к условиям среды, а с другой, – процесс приспособления живых организмов к часто изменяющимся условиям среды [27].

    1. Классификация стрессоров

    Растительные организмы в природных условиях почти всегда подвергаются воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Способность растений сопротивляться экстремальным условиям произрастания, приспосабливаться к ним и сохранять при этом свой жизненный потенциал - одно из главных условий существования растений. Оно зависит от возможности реализовать защитно-приспособительные механизмы, иными словами адаптироваться к различным стрессовым воздействиям.

    Стрессорный фактор, или стрессор – в значительной степени действующий фактор внешней среды, который способен вызвать в организме повреждение или даже вызвать летальный исход. Если повреждающее действие стрессора превышает защитные возможности организма, то можно говорить об экстремальном факторе.

    Интенсивность (доза) стрессора, приводящая к гибели организма, называется летальной дозой и характеризуется, как − ЛД50, т. е. интенсивностью действующего фактора, при которой гибнет половина растений. В наибольшей степени главными неблагоприятными для растений факторами оказываются засуха, высокие и низкие температуры, избыток воды и солей в почве, недостаток кислорода, присутствие в атмосфере вредных веществ, ультрафиолетовая радиация, ионы тяжелых металлов, фитопатогены. Бывают критические периоды воздействия стрессовых факторов на растения. Обнаружено, что растения более устойчивы в покоящемся состоянии (в виде семян, луковиц, клубней). Наиболее же чувствительны растения в молодом возрасте (период появления всходов, период формирования гамет, во время цветения и плодоношения). Экологический фактор обладает определенными количественными показателями: интенсивность и диапазон действия. В соответствии с рисунком 1.1 действия фактора характеризуются его амплитудой.

    Рисунок ‒ 1.1Схема действия экологического фактора на жизнедеятельность организмов

    1, 2, 3– точки минимума, оптимума и максимума соответственно;

    I, II, III – зоны пессимума, нормы и оптимума соответственно.

    Точка 2 на оси абсцисс, которая обладает наилучшим показателям жизнедеятельности организма, показывает более благоприятную для организма величину воздействующего фактора – это точка оптимума. Для многих организмов выявить оптимальное значение фактора с достаточной точностью чаще всего трудно, в связи с этим принято говорить о зоне оптимума. Крайние участки кривой, показывающие состояние угнетения организмов при резком недостатке или избытке фактора можно называть областями пессимума или стресса. Вблизи критических точек лежат сублетальные величины фактора, а за пределами зоны выживания – летальные.

    1. Стресс у растений. Теория Г. Селье

    У растений, в согласии с теорией Г. Селье, можно выделить три последовательные фазы ответной реакции на воздействие неблагоприятных факторов (рисунок 1.2):

    1. первичная стрессовая реакция (тревога и торможение процессов жизнедеятельности)
    2. Адаптация (стадия резистентности),
    3. Истощение (когда адаптивный потенциал растений слишком мал для того противостояния к влиянию стрессора)

    Рисунок 1.2 − Триада Г. Селье

    Чем меньше при стрессе физиологические функции отклоняются от своей нормы и быстрее функция принимает норму после прекращения воздействия фактора, тем больше устойчивость растения к этому фактору. Несильные и кратковременные изменения внешней среды в неблагоприятную для растений сторону чаще всего не могут привести к существенным нарушениям физиологических процессов у растений. Это обуславливается всем комплексом приспособлений, которые позволяют им сохранять относительное постоянство функции при постоянно изменяющихся условиях среды.

    В результате хозяйственной деятельности человека выявляют новые неблагоприятные факторы, которые растения не  способны переносить. Эти факторы не участвовали в эволюции данного вида. В связи, с чем растения не имеют специфических механизмов формирования устойчивости к ним. В примеры можно привести гербициды, вредные газы, тяжелые металлы и другие ксенобиотики, другими словами, вещества, чужеродные живому организму [3].

    Вфитофизиологии определение «стресс» применяется в нескольких аспектах. В одних случаях «стресс» служит синонимом слову «воздействие» (стрессовое воздействие, стрессовый фактор, стрессовые нагрузки, индуцированный стресс и т.д.), если стресс отражает количественную сторону раздражителя. В других случаях, когда, к примеру, говорят о водном, солевом или окислительном стрессе, то под стрессом считают целый комплекс ответных неспецифических и специфических изменений.

    Обязательным свойством любого живого организма, включая высшие растения, является способность к защите от действия неблагоприятных факторов среды. Эта функция возникла одновременно с появлением первых живых организмов и в ходе дальнейшей эволюции развивалась и совершенствовалась. На каждой стадии развития способность растений к приспособлению к неблагоприятным условиям выражена в различной степени. Эта способность растений относится к глубоким изменением обмена, а также выявляется быстротой и глубиной его изменения без нарушения согласованности между отдельными функциями, посредством чего не нарушается единство организма и среды. Это, в результате, и определяет жизнедеятельность организма и его выносливость [2].

    Для высших растений типичен активный путь адаптации к неблагоприятным факторам среды. Примером является путь адаптации к неблагоприятным условиям водного режима. По причине целому комплексу гидрорегулирующих приспособлений, проявляющихся на любой стадии онтогенеза и отличающихся автоматизмом и динамичностью действия, растения имеют способность противостоять иссушающему действию факторов внешней среды. К таким приспособлениям, всегда направленным на усиление поглощения и снижение испарения воды, относят усиленный рост корневой системы, возрастание водоудерживающей способности, закрывание устьиц и др.

    Динамичное избирательное отношение растительного организма к неблагоприятным, стрессовым условиям внешней среды определяется в его способности к саморегуляции, оптимизации протекающих в нем процессов. Еще одним примером может служить их приспособление к факторам внешней среды, с которыми организм находится в непрерывном взаимодействии на протяжении всего онтогенеза. Сюда принимают устойчивость к недостатку или избытку воды, низким и высоким температурам, недостатку кислорода, засолению и загазованности среды, ионизирующему излучению, инфекциям и др. Все перечисленные неблагоприятные факторы в последнее время чаще всего называют стрессорами, а реакцию организма на любые отклонения от нормы – стрессом.

    Вопрос о природе защитных реакций, которые растение способно противопоставить гибельному влиянию перечисленных выше факторов, а также которые могут позволить организму сохранить нормальный ход процессов развития, включая и функцию самовоспроизведения, изучается на протяжении большого количества времени. По происхождению и характеру действия все экологические факторы разделяют на группу абиотических и группу биотических. К первой относят факторы не живой природы, а ко второй  группу, связанную с влиянием живых существ. Это разделение условно, так как многие абиотические факторы переносят большое влияние жизнедеятельности живых организмов [28].

    1. Адаптация у растений

    Выделяют различные подходы к определению термина «адаптация». Примерами являются:

    1. Адаптация по Кузнецову – это генетически детерминированный процесс формирования защитных систем, который обеспечивает повышение устойчивости и протекание онтогенеза в ранее неблагоприятных для него условиях.
    2. Адаптация по Усманову – совокупность морфологических, физиологических и биохимических первичных приспособительных реакций, представляющих возможность видоспецифического выживания растений при действии вертикальных и горизонтальных биотических связей.

    Адаптация является одним из главных механизмов, который усиливает устойчивость биологической системы в изменившихся условиях существования. Чем лучше организм адаптирован к какому-то фактору, тем он устойчивее к его колебаниям. Адаптация включает в себя все процессы (анатомические, морфологические, физиологические, поведенческие и др.), способствующие повышению устойчивости и выживанию вида [8].

    Выделяют несколько главных стратегий адаптации: эволюционные и онтогенетические:

    1. Эволюционные (филогенетические) адаптации – это адаптации, которые возникают в ходе эволюционного процесса на основе генетических мутаций, отбора и передающиеся по наследству. Системы выживания, сформированные в процессе эволюции, наиболее надежны. Они, чаще всего, функционируют в течение всего онтогенеза в стрессорных, а также в оптимальных условиях. Тем не менее, изменения условий среды, в большинстве случаев, являются слишком быстрыми для возникновения эволюционных приспособлений. В этих случаях растения используют в место постоянных индуцируемые стрессором защитные механизмы. Их формирование генетически предопределено (детерминировано). В образовании таких защитных систем относят изменение дифференциальной экспрессии генов.
    2. Онтогенетические (фенотипические) адаптации - обеспечивают выживание данного организма. Они не связаны с генетическими мутациями и не могут передаваться по наследству. Формирование такого рода адаптаций требует сравнительно много времени, благодаря этому их называют долговременными адаптациями. Так как организмы имеют способность к адаптации, то при адаптации к стрессовому фактору возможно увеличение эластичной и пластичной устойчивости растений к нему [20].

    Эластичная устойчивость является мерой способности организма предупреждать обратимые физико-химические изменения при действии стрессора, а пластичная устойчивость определяется мерой способности организма предупреждать необратимое напряжение, другими словами физико-химические повреждения.

    Адаптация может являться стабильной, благодаря закреплению в процессе эволюции в ряде поколений, или нестабильной, зависящей от стадии развития организма и факторов окружающей среды. Адаптация, которая приводит к возрастанию пластичной устойчивости, предохраняет организм от повреждения стрессором, вызывающим повреждения у неадаптированного организма. Этот тип адаптации называют адаптацией к экстремальным воздействиям фактора среды. Такая адаптация предполагает устойчивость к повреждению при действии стрессового фактора, но если оно продолжается достаточно большое количество времени, то оно может приводить к повреждению и смерти организма. Способность организма жить, расти и размножаться в присутствии стрессового фактора, была названа адаптацией к воздействиям фактора среды.

    Оба пути адаптации включают устойчивость к стрессу. Поэтому в некоторых случаях их еще называют эластичная и пластичная адаптации. В эколого-физиологических исследованиях выделяют толерантность и резистентность организма по отношению к факторам среды. Организм может жить в определенных условиях внешней среды. Абиотические факторы среды имеют минимальные и максимальные значения, за пределами которых организм погибает. Эти значения являются пороговыми, при которых еще возможна жизнь данного конкретного вида. Они определяют нижнюю и верхнюю границы его толерантной зоны. Уровни которой, очень часто выходят за область оптимальных значений. В пределах толерантной зоны, которые обусловлены генотипом, колебания фактора не грозят организму гибелью.

    Организм, чаще всего, не использует все свои потенциальные возможности и функционирует в зоне более узкой, чем это позволяет генотип. За пределами зоны толерантности находится зона резистентности – зона действия летальных уровней воздействия, зона смерти.

    Благодаря этому выделяют приспособления к умеренным воздействиям, другими словами зону толерантности и адаптации к экстремальным воздействия, т.е. зону резистентности. Адаптация в зоне толерантности базируется на изменении метаболизма и энзиматической активности, которое происходит под влиянием изменившейся активности генетического аппарата организма, а также в результате непосредственного влияния на активность метаболизма изменившегося фактора. Только в пределах зоны толерантности работают механизмы физиологической адаптации, которые способствуют проявлению потенциальных возможностей генотипа. В зоне же резистентности организм работает не на нормализацию метаболизма, а на репарацию повреждения и увеличение времени жизни клеток при экстремальных изменениях условий среды [26].

    1. Типы повреждений растений под действием стрессоров

    Если стрессовый фактор действует на растение, то он может вызывать повреждение различными путями:

    1. Стресс может индуцировать прямое пластичное напряжение, вызывающее повреждение. Это можно определить первичным стрессоповреждением, которое выявляется по скорости его появления. Не исключено, что в этом случае растение может погибнуть за очень сжатое время (секунды или минуты). Примерами являются, быстрое замораживание, вызванное низкотемпературным стрессом. Когда цитоплазма замерзает, ледовые кристаллы разрывают плазмалемму, что вызывает резкую потерю полупроницаемости и смерть клетки.

    2. Стресс также вызываает эластичное напряжение, которое не опасно само по себе и является обратимым. Но если оно сохраняется достаточно длительное время, эластичные (обратимые) изменения могут косвенно повышать пластичные (необратимые) изменения, которые приводят к повреждению или смерти растения. Это называется непрямым стрессоповреждением. Оно выявляется по длительной экспозиции (часы и дни) в стрессовых условиях до повреждения. К примеру, когда некоторые растения слишком большое количество времени находятся при низкой температуре, это приводит их к замораживанию. В ряде случаях изменения могут стать преимущественно эластичными, которые выражаются в постепенном замедлении физических и химических процессов у растения, и поэтому могут быть не вредными. В других случаях это замедление может привести к нарушению клеточного метаболизма, которое вызывает недостаток метаболических соединений и продукции токсичных веществ.

    3. Не исключено, что стресс может повреждать растение путем вторичного стресса , а не путем напряжения, которое он вызывает. Примером является высокая температура, которая в ряде случаев может не быть повреждающей сама по себе, но вызывающей дефицит воды, который в свою очередь повреждает растение. Так как вторичный стресс требует, какое-то время для своего проявления, для развития вторичного стрессового повреждения также нужна относительно длительная экспозиция растения в присутствии первичного стрессового фактора.

    Вторичный стресс также может вызывать прямое или непрямое повреждение и давать начало третичному стрессу и т.д. Стрессы, которым могут быть подвержены растительные организмы, делят на два вида:

    1. Стресс лимитирования, который вызван слишком малым снабжением ресурсов (слабый свет или недостаток биогенов).
    2. Разрушительный, дисруптивный стресс, который является результатом повреждения, вызванного неблагоприятными условиями, а также перераспределением ресурсов, для того, чтобы предотвратить возможное повреждение [24].

    1. Ферменты

      1. Активность и классификация ферментов

        Ферменты –белки, которые обладают каталитической функцией при помощи наличия в их структуре активных центров, высокоспецифичных к субстрату – веществу, подвергающемуся ферментативному воздействию. Образуются и функционируют во всех живых организмах (фермент от латинского «fermentum» – «закваска»; энзим от греческого«эн» «в», «внутри»,«зиме» – «закваска»). Образование терминов связано с тем, что изначально ферментативные процессы были открыты и изучены в бродильном производстве [31].

        Ферменты в отличие от неорганических катализаторов довольно часто могут сами участвовать в химических превращениях веществ, при этом образуя промежуточные нестойкие соединения с теми веществами, на которые они воздействуют. Состояние раздробления в коллоидном растворе, где содержатся ферменты, создает огромную поверхность соприкосновения их с веществом, которое подвергается превращению. Ферменты обеспечивают согласованность, а также последовательность реакций обмена веществ.

        По особенностям строения, разделяют однокомпонентные и двухкомпонентные ферменты. Первые состоят целиком из вещества белковой природы. Это ферменты амилаза, пепсин и др. Двухкомпонентные ферменты более распространены, состоят из более крупной части белкового характера (апофермент, или носитель) и более мелкой части из низкомолекулярного специфического вещества небелкового характера (кофермент, или простетическая группа). Ряд ферментов содержит в качестве простетической группы тот или другой витамин (В1, В2, РР и др.) [16].

        Количество того или иного фермента достаточно трудно определяется, в связи с этим при исследованиях чаще всего имеют дело с понятием, которое называется активностью фермента, определяют ее по скорости ферментативного превращения вещества.

        На скорость ферментных реющий в основном влияние оказывают температура и кислотность среды. Для каждого фермента существует оптимальная температура и оптимальное рН среды. Как правило, оптимальная температура находится в пределах 40-50 °C. Ферменты могут действовать при температурах даже ниже 0 °C. При высоких температурах (около 100 °C) ферменты окончательно становятся недеятельными из-за денатурации белкового компонента [22].

        К особенностям ферментов относят специфичность их действия (крахмал осахаривается только амилазой, клетчатка – только цитазой и т. п.). Название фермента чаще всего составляют из названия расщепляемого вещества с добавлением суффикса аза. Например, мальтоза – мальтаза, целлюлоза – целлюлаза. Исключением являются названия только некоторых ферментов: диастаз, инвертаза, пепсин и др.

        Ферменты встречаются во всех живых клетках разнообразных растений. Они содержатся в корнях, стеблях, листьях, цветках, плодах. Особенно много их присутствует в растущих клетках, например в прорастающих семенах, в пыльцевых зернах и др.

        В настоящее время существует около 450 различных ферментов. В соответствии от характера действия ферменты подразделяютт на шесть главных классов, в каждом из которых несколько подклассов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидролазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы).

        Оксидоредуктазы. К этому классу относят ферменты, которые катализируют с участием двух субстратов окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Систематические названия их можно составить по форме «донор: акцептор - оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД+- оксидоредуктаза для лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [6].

        Рассматривают следующие основные оксидоредуктазы:

        1. аэробные дегидрогеназы или оксидазы, которые катализируют перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород;
        2. анаэробные дегидрогеназы, способность ускорять перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород;
        3. цитохромы, могут катализировать перенос только электронов. К этому классу  также относят гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, которые катализируют реакции с участием перекиси водорода.

        Трансферазы. К данному классу относят ферменты, способные катализировать реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляют по форме «донор: транспортируемая группа-трансфераза» .

        Выделяют трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и других. Примером является: метил- и формилтрансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и другие.

        Гидролазы. В этом классе содержится большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ с участием молекулы воды. Их наименование составляется по форме «субстрат-гидролаза». К ним относят: эстеразы – ферменты, способные катализировать реакции гидролиза и синтеза сложных эфиров; гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей; фосфатазы и пептидгидролазы, которые катализируют гидролиз фосфоангидридных и пептидных связей; амидазы, а также ускоряют разрыв амидных связей, отличных от пептидных [31].

        Лиазы.К этому классу относятся ферменты, которые катализируют разрыв связей С–О, С–С, С–N и других, и обратимые реакции отщепления различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Данные реакции сочетаются образованием двойной связи или присоединением групп к месту разрыва двойной связи. Ферменты можно обозначить термином «субстрат-лиазы». Примером является фумарат-гидратаза, которая катализирует обратимое отщепление молекулы воды от яблочной кислоты с дальнейшим образованием фумаровой кислоты. В эту же группу входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и так далее. [26].

        Изомеразы. К данному классу относятся ферменты, катализирующие взаимопревращения оптических и геометрических изомеров. Систематическое название их можно составить с учетом типа реакции: «субстрат-цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутримолекулярный перенос группы, то фермент имеет название «мутаза».

        Также к классу изомеразы относят рацемазы и эпимеразы, которые действуют на амино- и оксикислоты, углеводы и их производные; внутримолекулярные оксидоредуктазы, способные катализировать взаимопревращения альдоз и кетоз; внутримолекулярные трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и другие группы, и тому подобное [31].

        Лигазы (синтетазы). В этом классе существуют ферменты, катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул благодаря использованию энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата). Систематическое название составляется по форме «X: Y лигаза», где X и Y обозначают исходные вещества [6].

        1. Каталаза

          Фермент каталаза относят к оксидоредуктазам – обширный класс ферментов, которые способны катализировать разложение возникающего в процессе биологического окисленияпероксид водорода на воду и молекулярный кислород (2H2O2 → 2H2O + O2). Каталаза в присутствии пероксида водорода окисляет низкомолекулярныеспирты инитриты.

          Каталаза была получена в кристаллическом состоянии. Её молекулярная масса оценивается в 250кДа. Этот фермент широко распространяется в клетках животных, растений и микроорганизмов. Относится кхромопротеидам, который имеет в качестве простетической (небелковой) группы окисленныйгем. Специфичность каталазы по отношению к субстрату-восстановителю невелика, благодаря этому она может катализировать не только разложение перекиси водорода, но и также окисление низшихспиртов.

          Основной функцией каталазы является способность катализироватьреакцию разложения перекиси водорода до безвредных для организма веществ. Также большое значение имеет для жизнедеятельности клеток, потому как защищает их от разрушения активными формами кислорода. Представляет собой тетрамер из четырех полипептидных цепей, каждая из которых имеет длину более 500 аминокислот. Фермент имеет в своем составе четыре группы порфирового гема, по причине которым вступает в реакцию с активными формами кислорода [6].

          1. Активность каталазы и ее методы определения

          Для выделения и очистки ферментов используется лишь один реальный в настоящее время способ получения - это выделение их из биологических объектов. Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого нужно очень тонкое измельчение исходного материала, близкого до разрушения субклеточных структур. Активность фермента определяют трехмерной структурой.

          Каталитической активностью может обладать лишь определенный участок молекулы фермента, который называется активным центром. Под влиянием различных факторов способна изменяться структура молекулы белка, ее конфигурация и фермент, они теряют свою активность. Наглядным примером влияния на биохимическом процессе в организме является фермент каталаза.

          Для того чтобы определить активность каталазы фиксируют получившийся в процессе реакции кислород, что осуществляют манометрическим или полярографическим методами. Также возможна регистрация кислорода с помощью измерения текущей концентрации перекиси водорода спектрофотометрическим методом или остаточной концентрации йодометрическим, перманганатометрическим либо иными титриметрическими методами.

          1. Характеристика и токсичность тяжелых металлов

            Термин «тяжелые металлы» связан с высокой относительной атомной массой. Такая характеристика чаще всего уподобляется с представлением о высокой токсичности. Одним из признаков, позволяющим относить металлы к тяжелым, является их плотность.

            Согласно сведениям, которые представлены в «Справочнике по элементарной химии», к тяжелым металлам относят элементы, плотность которых более 5 г/см3. Если исходить из этого показателя, то тяжелыми нужно считать 43 из 84 металлов Периодической системы элементов.

            Таким образом, к тяжелым металлам относят более 40 химических элементов с относительной плотностью более 6 г/см3. Число опасных загрязнителей значительно меньше, если при этом учитывать токсичность, стойкость и способность накапливаться во внешней среде, а также масштабы распространения указанных металлов. В большинстве случаев, представляют интерес такие металлы, которые наиболее широко и в значительных объемах используются в производственной деятельности, а также в результате накопления во внешней среде представляют крупную опасность с точки зрения их биологической активности и токсических свойств. К таким относят свинец, ртуть, кадмий, цинк, висмут, кобальт, никель, медь, олово, сурьму, ванадий, марганец, хром, молибден и мышьяк.

            Тяжелые металлы могут образовывать сложные комплексные соединения с органическими веществами почвы, благодаря этому в почвах с высоким содержанием гумуса они менее доступны для поглощения. Переходу тяжелых металлов в низшие степени окисления и в растворимые формы способствует избыток влаги в почве. Доступность тяжелых металлов растениям повышают анаэробные условия.

            Тяжелые металлы накапливаются в почве и очень медленно удаляются при выщелачивании, потреблении растениями, эрозии и дефляции (выдувании почв) [1].

            Период полуудаления или удаления половины от начальной концентрации составляет продолжительное время: для цинка – от 70 до 510 лет, для кадмия – от 13 до 110 лет, для меди – от 310 до 1500 лет, для свинца – от 740 до 5900 лет.

            Повышение концентрации тяжелых металлов в природных водах чаще всего связывается с другими видами загрязнения. Примером является закисление. Благодаря выпадению кислотных осадков наблюдается снижение значения рН и переход металлов из сорбированного на минеральных и органических веществах состояния в свободное.

            В последнее время в связи с резким развитием промышленности встречается значительное накопление твердых металлов в окружающей среде. Это элементы, у которых физиологическая роль на данный момент времени не выяснена (Cd,Hg,Pb и др.), и металлы, требуемые для нормальной жизнедеятельности растений (Cu,Co,Zn и др.). Последние металлы в низких концентрациях играют значительную роль как кофакторы многих ферментативных реакций, но при избытке могут приносить значительный вред растительному организму, здоровью животных и человека[10].

            Атмосферные выбросы промышленных предприятий и объектов теплоснабжения являются основным источником поступления тяжелых металлов в почвы; поступают с отходами промышленности, из атмосферы, со сточными водами, выбросами транспорта, минеральными удобрениями, пестицидами.

            Токсичность тяжелых металлов, чаще всего, определяется их ингибирующим действием на ферментативную активность. Устойчивы комплексы ферментов с ионами тяжелых металлов. Ингибирование принимает необратимый характер, из этого следует, изменение скорости процессов метаболизма и синтеза, а также возникновение мутаций. Все перечисленные факторы приводят к нарушению структуры и проницаемости клеточных мембран.

            Большая часть процессов ингибирования ферментативной активности сказываются на процессах жизнедеятельности негативно. Молекулярный механизм ингибирующего действия ионов металлов на каталитическую активность ферментов установить довольно трудно. Металл может конкурировать с субстратом за места связывания в активном центре. В то же время он может взаимодействовать с различными группами белковой молекулы, которые находятся вне активного центра, но при этом способные влиять на каталитические функции фермента, иными словами связываться с аллостерическим центром фермента[30].

            Кадмий и медь являются в наибольшей степени важными металлами при изучении проблемы загрязнений, так как они широко распространены в мире и к тому же обладают токсичными свойствами.

            1. Источники и пути поступления тяжелых металлов в окружающую среду

            Все источники поступления загрязнителей разделяют на природные и антропогенные. В числе природных источников поступления тяжелых металлов в атмосферу выделяются ветровая эрозия, извержения вулканов, лесные пожары испарение с поверхности почв и растений, и др.

            Тяжелые металлы занимают особое место из крупного числа различных химических веществ, которые поступают в окружающую среду из антропогенных источников. К тому же для кадмия, цинка и свинца доля антропогенных поступлений в атмосферу в значительной степени превышает природные.

            По хозяйственным и территориальным признакам источники металлотоксикантов делят на локальные и пространственные. По скорости эмиссии в окружающую среду и объекты живой природы делят на регулярные и залповые источники.

            Главной опасностью для окружающей среды являются распределенные в пространстве источники тяжелых металлов, потому что, именно они загрязняют сравнительно большие территории. К такой группе относятся: автомобильный транспорт, сельскохозяйственные угодья (после обработки содержащими металлы пестицидами), домашние печи, использующие уголь. Тяжелые металлы поступают также при потерях перевозимого сырья и руд, в составе сточных вод предприятий.

            Самым главным источником атмосферного загрязнения являются тепловые электростанции  и предприятия по добыче и изготовлению строительных материалов. Загрязнение сельскохозяйственных угодий тяжелыми металлами в основном происходит за счет атмосферных выбросов предприятий, отходов животноводческих ферм и из − за применения минеральных удобрений и ядохимикатов. Органические удобрения – навоз и компост, тоже содержат большоее количество тяжелых металлов. В результате внесения в почву органики, в нем увеличивается концентрация таких химических элементов как свинец, кадмий, медь, цинк, железо, марганец. Учитывая медленное выведение тяжелых металлов из почвы, при длительном поступлении даже относительно небольших количеств кадмия и свинца, их концентрация со временем достигает достаточно высоких показателей.

            Существуют различные формы нахождения тяжелых металлов в окружающей среде:

            1. В атмосферном воздухе тяжелые металлы существуют в форме органических и неорганических соединений. Главными источниками считаются выхлопные газы автомобилей и дымовые выбросы промышленных предприятий. При этом аэрозоли свинца, кадмия, меди и цинка состоят преимущественно из субмикронных частиц, а аэрозоли никеля и кобальта – из крупнодисперсных частиц, образующихся в основном при сжигании дизельного топлива.
            2. В водных средах металлы существуют в трех формах: взвешенные частицы, коллоидные частицы и растворенные соединения. Растворенные представлены свободным ионами и растворимыми комплексными соединениями с органическими (гуминовые кислоты) и неорганическими (галогениды, сульфаты, фосфаты, карбонаты) лигандами. Значительное влияние на содержание таких элементов в воде оказывает гидролиз, который во многом определяет форму нахождения элемента в водных средах. Большая часть тяжелых металлов переносится поверхностными водами во взвешенном состоянии.
            3. В почвах тяжелые металлы существуют в водорастворимой, ионообменной и непрочно адсорбированной формах. Водорастворимые формы, чаще всего, представляются хлоридами, нитратами, сульфатами и органическим комплексными соединениями. Помимо того, ионы тяжелых металлов могут связываться с минералами как часть кристаллической решетки [13].

            1. Нормирование тяжелых металлов

            Экологический мониторинг – это система наблюдений, оценки и прогноза, которая позволяет выявить изменения состояния окружающей среды под влиянием антропогенной деятельности.

            Мониторинг в условиях крупных индустриальных центров имеет свои особенности. Это полиметальность состава техногенных выбросов и, тем самым, возникающие трудности при экологической оценке выявленного загрязнения; а также сложности при выборе почвенного фона и при характеристике буферной способности загрязняемой почвы по отношению к тяжелым металлам.

            В основе измерения баланса экологических и экономических интересов человека лежат нормативы.

            Экологические и физиологические аспекты воздействия тяжелых металлов на городские экосистемы проявляются в соответствующих пространственных аномалиях. Так как техногенные аномалии чаще всего имеют полиэлементный состав, то для них рассчитывают суммарный показатель загрязнения (СПЗ).

            Как следствие, при попытках нормирования антропогенного загрязнения пользуются разработкой предельно допустимых концентраций (ПДК).

            Предельно допустимая концентрация (ПДК) – это количество вредного вещества в окружающей среде, которое относится к массе или объему ее конкретного компонента. При постоянном контакте или при воздействии за определенный промежуток времени почти не влияет на здоровье человека и не способствует развитию неблагоприятных последствий у его потомства [25].

            Многие тяжелые металлы проявляют высокую токсичность в следовых количествах и концентрируются в живых организмах. Благодаря этому разрабатывают санитарно-гигиенические нормативы главной функцией, которых является оценка опасности токсикантов различной природы на здоровье человека.

            Человеческий организм содержит многие металлы, хотя и в весьма небольших концентрациях. Отдельные элементы могут являться составной частью ферментов и гормонов. Они относятся к жизненно необходимым составляющим.

            1. Кадмий

              Кадмий(Cadmium) Cd, – это химический элемент 12 (II b) группы Периодической системы. Его атомный номер 48, относительная атомная масса 112,41.Степень окисления +2, редко +1.

              Кадмий принормальных условиях является мягкимковкимтягучимпереходным металлом. Его цвет серебристо-белый. Кадмий устойчив в сухом воздухе, а во влажном на его поверхности образуется плёнкаоксида, которая препятствует дальнейшемуокислению металла.

              Пары кадмия могут взаимодействовать с парами воды с выделением водорода. Кислоты растворяют кадмий с дальнейшим образованием солей этого металла. Он восстанавливает нитрат аммония в концентрированных растворах до нитрита аммония, а также окисляется в водном растворе катионами некоторых металлов, примерами являются медь(II) и железо(III). В отличие от цинка, с растворами щелочей кадмий не взаимодействует [15].

              Основными источниками кадмия являются промежуточные продукты цинкового производства. Осадки металлов, которые получены после очистки растворов сульфата цинка действием цинковой пыли, содержат 2–12 – процентов кадмия. Во фракциях, образующихся при дистилляционном получении цинка, содержится 0,7–1,1 – процентов кадмия, а во фракциях, полученных при ректификационной очистке цинка – до 40 – процентов кадмия. Кадмий получают и из пыли свинцовых и медеплавильных заводов (она может содержать до 5 – процентов и 0,5 – процентов кадмия, соответственно). Пыль чаще всего обрабатывают концентрированной серной кислотой, а далее сульфат кадмия выщелачивают водой.

              Из растворов сульфата кадмия действием цинковой пыли осаждают кадмиевую губку, после этого ее растворяют в серной кислоте и очищают раствор от примесей действием оксида цинка или карбоната натрия и методами ионного обмена. Металлический кадмий выделяют электролизом на алюминиевых катодах или восстановлением цинком [14].

              Для растительного организма кадмий также в свою очередь очень токсичен. Он легко всасывается из почвы через корневую систему и из атмосферы. Локализуется чаще всего в корнях и в меньшей степени – в стеблях, черешках и главных жилках листьев.

              Как правило, содержание кадмия в растениях составляет 0,001 - процента (на сухое вещество). В зонах повышенного содержания кадмия в почве встречается 20–30–кратное увеличение его концентрации в наземных частях растений в отличие от растений незагрязненных территорий. Загрязненные растения содержат до 400 мг/кг кадмия и больше. В противоположность другим минеральным элементам (за исключением цинка) кадмий может накапливаться в достаточно больших количествах в генеративных органах. В среднем его содержание в семенах растений, растущих на загрязненных территориях, растет до 4 мг/кг (в семенах растений из сравнительно «чистых» местообитаний – 0,2 мг/кг кадмия) [4].

              При повышенном содержании кадмия у растений можно наблюдать хлороз листьев, красно–бурый цвет их краев и прожилок, задержку роста и повреждение корневой системы. Основной источник кадмиевого загрязнения почв – это внесение удобрений, в большей части суперфосфата, куда кадмий входит в качестве микродобавки [14].

              1. Медь

              Медь принимает промежуточное положение между элементами первой триады VIII группы и щелочными элементами I группы системы Менделеева. Медь, как и железо, кобальт, никель, расположенна к комплексообразованию и дает окрашенные соединения, нерастворимые сульфиды и так далее.

              Сходство со щелочными металлами невелико. Так, медь образует ряд одновалентных соединений, но для нее более характерным является двухвалентное состояние. Соли одновалентной меди в воде почти нерастворимы и могут легко окисляться до соединений двухвалентной меди. Соли двухвалентной меди, наоборот, хорошо растворимы в воде и в разбавленных растворах полностью диссоциированы.

              Гидратированные ионы Сu+2 окрашены в голубой цвет. Также существуют соединения, в которых медь трехвалентна. Таким образом, благодаря действию пероксида натрия на раствор куприта натрия Nа2СuО2 получен оксид Сu2О3 − красный порошок, который начинает отдавать кислород  при 100 °С. Сu2О3 является сильным окислителем (например, выделяет хлор из соляной кислоты) [17].

              Среднее содержание меди в растениях 0,2 мг на кг сухой массы. В растительную клетку медь попадает в форме иона (Cu2+). Максимальное количество меди поглощается растением на ранних стадиях развития.

              Медь принадлежит к эссенциальным элементам, которые в незначительной степени необходимы для метаболизма, роста и развития растений, однако при избытке в среде проявляют достаточно сильное токсическое действие[19].

              Диапазон концентраций меди, который обеспечивает оптимальный клеточный метаболизм и развитие растений, в сильной степени узок. Считают, что даже их двукратное превышение способно оказывать негативное действие, тогда как высокие концентрации меди могут вызывать токсичные синдромы (хлорозы и некрозы, ингибирование роста корней и побегов), вплоть до смерти[11].

              Активность в растениях гормонов роста и развития – ауксинов регулирует фермент полифенолоксидаза. В растениях до 75 - процентов меди концентрируется в хлоропластах, где сосредоточен белок синего цвета пластоцианин, содержащий медь. Этот белок достаточно активно участвует в транспорте электронов при фотосинтезе.

              При недостатках меди выявляется снижение активности медьсодержащих ферментов, которые участвуют в процессах дыхания и фотосинтеза. Вследствие чего, в растениях снижается уровень растворимых углеродов. Недостаток меди в большей степени влияет на развитие семян, зерен, чем на рост вегетативной массы. Из этого следует, что для нормального образования и функционирования генеративных органов растениям потребуется намного больше меди, чем для формирования вегетативных частей растения.

              Вызванные недостатком меди нарушения процессов фотосинтеза и дыхания чаще всего отражаются на энергетическом обмене растения, что может спровоцировать каскад вторичных физиологических эффектов [4].

              Растения испытывают недостаток меди, а почвы считают бедными по содержанию данного элемента при содержимой меди в почвах.

              При избытке меди выявляется проявление симптомов отравления растений (фитотоксичность). Это хлороз молодых листьев, однако, жилки остаются зелеными, хлороз нижних листьев. Хлороз сопровождается появлением коричневой пятнистости и как следствие происходит опадение листьев [21].

              ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 1

              1. Амарант – это растение, имеющее богатый химический состав, в том числе отличающийся высоким содержанием белка.
              2. В естественных условиях произрастания, растения почти никогда не находятся в оптимальных ситуациях комплекса факторов внешней среды, постоянно испытывают действие стрессоров. Способность растения переносить действие неблагоприятных факторов и давать в таких условиях потомство называется устойчивостью.
              3. Адаптация является одним из важнейших механизмов, который повышает устойчивость биологической системы в изменившихся условиях существования.
              4. Об адаптации к изменяющимся условиям можно судить по изменению удельной активности фермента.

              1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

                1. Материалы исследования

                  Объектом исследования служили семена амаранта (Amaranthus) сорта Крепыш(Amaranthushypochondruacus) и щирицы (Amaranthus retraflexus L) , полученные в 2017 году в Амурской области, Благовещенского района в селе Верхнеблаговещенское.

                  Рисунок 2.1 −Амарант сорта Крепыш

                  Сорт амаранта Крепыш - раннеспелый сорт высотой 120-140 см. По стеблю растения расположены густооблиственные побеги. Листья зеленые с красными прожилками, соцветие прямостоячее.

                  Рисунок 2.2 − Щирица запрокинутая

                  Щирица запрокинутая - однолетнее травянистое растение, густо серовато-пушистое. Стебель растения прямой, ветвистый. Листья яйцевидно-ромбической формы, тупые, по краям волнистые и мелкозубчатые, соцветие зеленое.

                  1. Методика проращивания семян амаранта в растворах солей

                    Влияние тяжелых металлов на активность ферментов изучалось при проращивании семян в растворах сульфата меди(II) и сульфата кадмия с концентрациями указанными в таблице 1 в течение одних, трех и пяти суток при комнатной температуре.

                    Таблица 1 − Концентрации растворов солей, используемые для интоксикации семян амаранта

                    СОЛЬ

                    КОНЦЕНТРАЦИЯ

                    CuSO4

                    0,0001 Моль/л

                    0,001 Моль/л

                    0,01 Моль/л

                    СdSO4

                    0,0001 Моль/л

                    0,001 Моль/л

                    0,01 Моль/л

                    Контролем служили семена амаранта, выдержанные в дистиллированной воде.

                    1. Приготовление экстрактов растворимых белков семян амаранта

                    Для получения экстрактов белков семян навеску материала (0.5 г) гомогенезировали в фарфоровой ступке в течение 15 мин. При температуре 0 – 50С. Растворимые белки экстрагировали 0,15 М раствором хлорида натрия. Полученный экстракт центрифугировали 15 мин, при 3000 оборотах/мин осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость фильтровали через слой капроновой ткани (мельничный газ) для удаления липидной пленки.

                    1. Определения белка биуретовым методом

                    Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодействии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Биуретовая реакция белков не отличается высокой чувствительностью. Поэтому она применяется в тех случаях, когда содержание белка в исследуемом образце достаточно велико (не ниже нескольких миллиграммов на миллилитр).

                    Готовили биуретовый реактив, растворяя последовательно в мерной колбе на 250мл 0,375гCuSO42О и 1,5г сегнетовой соли (КООС−СНОН–СНОН –COONa4H2O) в 150мл воды. Медленно при постоянном перемешивании приливали 75мл 10-процентного раствора гидроксида натрия и доводят содержимое до 250 мл водой.

                    В отдельные пробирки добавляли по 0,1мл экстракта белка и 0,9 мл дистиллированной воды, затем в каждую из них приливали по 8мл биуретового реактива.

                    Оставляли на 30 минут при комнатной температуре, затем фотометрировали в кюветах при 540 нм с рабочей длинной 10 мм против контроля.

                    Определение проводили трижды, беря каждый раз новую серию стандартных растворов белка.

                    1. Метод определения удельной активности каталаз семян амаранта

                    манометрическим методом

                    Метод манометрического определения удельной активности каталаз основан на определении объема кислорода, выделившегося после прибавления пероксида водорода к экстракту растений. В реакционный сосуд прибора наливали 1,5 мл ферментного препарата и 3 мл пероксида водорода 3– процентного раствора. Реакционный сосуд закрывали пробкой с трубкой.

                    Уровень жидкости в приборе устанавливали на нулевой отметке градуировочной бюретки. После этого реакционный сосуд встряхивали и начинали отсчет времени. Объем выделяющегося газа (Δ) определяли через 3 минуты после начала реакции по изменению уровня жидкости в бюретке.

                    Удельную активность каталаз выражали в миллилитрах кислорода, который выделяется под действием фермента за три минуты на миллиграмм белка.

                    Ауд.=Δ/В

                    Где Δ - количество выделившегося кислорода (мл);

                    В- количество белка в пробе (мг).

                    ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 2

                    1. Отработаны методики:

                    - проращивания семян амаранта в солях тяжелых металлов,

                    -определения белка биуретовым методом,

                    - определения удельной активности каталазы семян амаранта манометрическим методом,

                    - приготовления экстрактов растворимых белков семян амаранта.

                    1. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ С РЕАКТИВАМИ И ОБОРУДОВАНИЕМ В ХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

                    1. Инструкция при работе на фотоэлектроколориметре КФК-2

                      1. Общие требования

                      1.1. К работе на фотоэлектроколориметре допускаются лица, прошедшие предварительно инструктаж.

                      2. Требования безопасности перед началом работы:

                      • одеть спецодежду;
                      • проверить заземление;
                      • проверить исправность и целостность токоведущих частей (розеток, вилок, проводов).

                      3. Требования безопасности во время работы:

                      • работа на фотоэлектроколориметре должна производиться в чистом помещении, свободном от пыли, паров кислот и щелочей;
                      • вблизи колориметра не должны располагаться громоздкие изделия, создающие неудобства в работе оператора;
                      • регулировочные работы, связанные с проникновением за постоянные ограждения к токоведущим частям колориметра, смена ламп, замена неисправных деталей, должны проводиться после отсоединения колориметра от электросети;

                      4. Требования безопасности по окончании работы:

                      • аппарат привести в исходное положение, отключить от электросети тумблером на приборе и из розетки;
                      • о замеченных недостатках доложить ответственному лицу.

                      5. Требования безопасности в аварийной ситуации:

                      • отключить аппарат от сети электропитания;
                      • сообщить заведующему кафедрой.

                      1. Работа с кислотами и щелочами

                        К числу крепких кислот относятся: азотная, серная, соляная, "царская водка" (смесь азотной и соляной кислот), паяльная ( раствор хлорида цинка в соляной кислоте), уксусная, щавелевая, фтористоводородная (плавиковая) и др. При попадании на кожу человека они вызывают сильные ожоги, а при попадании в глаза- потерю зрения. На коже появляются эритемы и ожогиII иIII степени в зависимости от концентрации кислоты. При обширных ожогах развивается шок.

                        При действии паров и туманов кислот наблюдается сильное раздражение слизистой оболочки носа, насморк, иногда носовые кровотечения, а также резкая боль в горле, чихание и кашель, чувство удушья, затрудненное дыхание, спазм голосовой щели, чувство стеснения и боль в груди. Могут появиться кровавая мокрота и рвота. В дальнейшем в зависимости от концентрации кислот возникают тяжелые воспалительные заболевания бронхов и легких. Попадая через рот , кислоты вызывают ожоги губ, углов рта, языка и кожи лица. Эти ожоги в зависимости от кислоты несколько отличаются по своей окраске: при ожоге азотной кислотой – желтые, серной – черноватые; уксусной – беловатые.

                        Особенно тяжелые ожоги слизистой оболочки полости рта, глотки, пищевода и желудка. Пострадавшие жалуются на резкую боль в полости, за грудиной и в надчревной области. Боль сопровождается мучительной рвотой с кровью, охриплостью голоса, иногда спазмом и отеком гортани. При отравлении азотной, серной и соляной кислотами случается даже прободение желудка. Прогноз при отравлении кислотами серьезен. Из щелочей наиболее широко применяются едкий натр, каустическая сода, едкое кали, аммиак, нашатырный спирт, углекислые щелочи и др. Едкие щелочи оказывают выраженное раздражающее и прижигающее действие на кожу и слизистые оболочки. Особенно опасно попадание их в глаза. Опасность отравления обуславливается величиной поражаемой поверхности.

                        При действии паров едких щелочей на глаза наблюдаются резкий отек и гиперемия конъюнктивы, помутнение роговицы, поражение радужной оболочки; при попадании в глаза химические ожоги, тяжесть которых определяется их распространенностью. Возможна слепота. Если едкие щелочи попадают на кожу, развивается тяжелый химический ожег. Клиническая картина отравлений через дыхательные пути подобна той, которая развивается при воздействии кислот. При поступлении внутрь появляются ожоги губ, слизистой оболочки полости рта, пищевода и желудка, сильная жажда, слюнотечение, а затем тошнота и рвота, часто с кровью, а также кровавый понос. При этом возникает сильная боль в полости рта, желудка, кишках, невозможность глотания. Кожа холодная, наблюдается снижение сердечной деятельности и артериального давления, а затем коллапс.

                        Для предупреждения ожогов и раздражения слизистых оболочек при работе с кислотами и щелочами все работы нужно проводить в вытяжном шкафу, с включенной вентиляцией, используя спецодежду, очки, перчатки, и другие средства индивидуальной защиты. Концентрированные щелочи в лабораторных помещениях должны храниться в толстостенной стеклянной посуде вместимостью не более 1 л с притертыми пробками на металлических подносах. Одним из главных средств для профилактики отравлений кислотами и щелочами является строгое хранение их в специально отведенных для этих целей местах, в стандартной таре. На емкостях с кислотами и щелочами обязательно должны быть этикетки с четкими надписями с указанием концентрации в процентах. Переноска кислот и щелочей одним человеком разрешается в емкости не более 5 л с установкой в металлическое ведро. Кислоты и щелочи запрещается набирать в пипетку ртом, необходимо применять резиновую грушу, и переливание этих жидкостей следует проводить при помощи стеклянных сифонов грушей.

                        При приготовлении растворов кислот их следует медленно приливать в воду тонкой струей. Эту работу лучше проводить в фарфоровых стаканах, т.к. она сопровождается сильным разогреванием. Твердые щелочи следует растворить в фарфоровой посуде, медленно прибавляя к воде небольшие кусочки щелочи и непрерывно перемешивая. Кусочки щелочи следует брать только фарфоровым шпателем или фарфоровой ложкой. При дроблении кусочков щелочи надо обязательно пользоваться защитными очками или щитками. Отработанные кислоты и щелочи следует собирать раздельно в специальную посуду и только после нейтрализации (рН=6.5-8.5) сливать в специально отведенное для этих целей место.

                        При проливе концентрированных растворов щелочей их засыпают песком или древесными опилками, затем песок и опилки собирают в емкость с водой и нейтрализуют. Облитое место обмывают раствором уксусной кислоты. При проливе кислоты ее вначале засыпают песком, затем песок собирают в емкость и нейтрализуют, а место, где была пролита кислота, засыпают известью или содой, промывают водой и вытирают насухо [18].

                        ВЫВОД ПО ГЛАВЕ 3

                        Изучена техника безопасности при работе с реактивами и оборудованием в химической лаборатории.

                        1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

                          Таблица 2 - Фактически полученные данныепо результатам изменения удельной активности каталаз

                          Концентрация 0,0001 моль/л

                          Время проращивания

                          стрессор

                          1 сутки

                          3 сутки

                          5 сутки

                          CuSO4(крепыш)

                          0,8; 0,8;

                          0,8; 0,9

                          0,3; 0,3;

                          0,2; 0,3

                          0,6; 0,5;

                          0,6; 0,6

                          CdSO4(крепыш)

                          0,9; 0,9;

                          0,8; 0,9

                          0,9;  0,9;

                          0,9; 0,8

                          0,5; 0,4;

                          0,4; 0,4

                          Н2О (крепыш)

                          1,1; 1,2;

                          1,1; 1,1

                          0,6; 0,5;

                          0,6; 0,6

                          0,5; 0,5;

                          0,4; 0,5

                          Н2О (щирица)

                          0,9; 0,8

                          0,9; 0,8

                          1,1; 1,0;

                          1,1; 1,1

                          0,4; 0,4;

                          0,3; 0,4

                          CuSO4(щирица)

                          0,7; 0,8;

                          0,9; 0,8

                          0,6; 0,6;

                          0,5; 0,6

                          0,3; 0,3;

                          0,4;0,4

                          CdSO4(щирица)

                          0,6;  0,6;

                          0,7; 0,6

                          1,0; 1,1;

                          1,0; 1,0

                          0,4; 0,4;

                          0,5; 0,4

                          Концентрация 0, 001 моль/л

                          CuSO4(крепыш)

                          0,7; 0,7;

                          0,6; 0,7

                          0,3; 0,3;

                          0,2; 0,3

                          0,5;   0,4;

                          0,5;  0,5

                          CdSO4(крепыш)

                          0,9; 0,9;

                          0,8; 0,9

                          0,9;  0,9;

                          0,9; 0,8

                          0,6;   0,6

                          0,7;   0,7

                          Н2О (крепыш)

                          1,1; 1,2;

                          1,1; 1,1

                          0,6; 0,5;

                          0,6; 0,6

                          1,2; 1,3;

                          1,4; 1,4

                          Н2О (щирица)

                          0,9; 0,8

                          0,9; 0,8

                          1,1; 1,0;

                          1,1; 1,1

                          3,0; 2,9;

                          3,1; 3,0

                          CuSO4(щирица)

                          0,4; 0,4;

                          0,5; 0,4

                          0,6; 0,6;

                          0,5; 0,6

                          0,9 ;   0,9;

                          0,8;    0,9

                          CdSO4(щирица)

                          0,6;  0,6;

                          0,7; 0,6

                          1,0; 1,1;

                          1,0; 1,0

                          0,9;   0,9;

                          1,0;   1,0

                          Концентрация 0,01 моль/л

                          CuSO4(крепыш)

                          0,7; 0,7;

                          0,6; 0,7

                          0,3; 0,3;

                          0,2; 0,3

                          0,5;   0,4;

                          0,5;  0,5

                          CdSO4(крепыш)

                          0,9; 0,9;

                          0,8; 0,9

                          0,9;  0,9;

                          0,9; 0,8

                          0,6;   0,6

                          0,7;   0,7

                          Н2О (крепыш)

                          1,1; 1,2;

                          1,1; 1,1

                          0,6; 0,5;

                          0,6; 0,6

                          1,2; 1,3;

                          1,4; 1,4

                          Н2О (щирица)

                          0,9; 0,8

                          0,9; 0,8

                          1,1; 1,0;

                          1,1; 1,1

                          3,0; 2,9;

                          3,1; 3,0

                          CuSO4(щирица)

                          0,4; 0,4;

                          0,5; 0,4

                          0,6; 0,6;

                          0,5; 0,6

                          0,9 ;   0,9;

                          0,8;    0,9

                          CdSO4(щирица)

                          0,6;  0,6;

                          0,7; 0,6

                          1,0; 1,1;

                          1,1; 1,0

                          0,9;   0,9;

                          1,0;   1,0

                          Таблица 2 – Содержание белка в семенах( проращивание в растворах солей)

                          Концентрация 0,0001 моль/л

                          Время проращивания

                          стрессор

                          1 сутки

                          3 сутки

                          5 сутки

                          CuSO4(крепыш)

                          0,007; 0,008; 0,009

                          0,097; 0,099; 0,099

                          0,025; 0,027; 0,024

                          CdSO4(крепыш)

                          0,013; 0,013; 0,012

                          0,087; 0,088; 0,088

                          0,046; 0,050; 0,044

                          Н2О (крепыш)

                          0,004; 0,005; 0,006

                          0,022; 0,025; 0,022

                          0,038; 0,042; 0,040

                          Н2О (щирица)

                          0,005; 0,004; 0,005

                          0,081; 0,085; 0,083

                          0,023; 0,029; 0,027

                          CuSO4(щирица)

                          0,024; 0,023; 0,023

                          0,076; 0,073; 0,072

                          0,031; 0,034; 0,031

                          CdSO4(щирица)

                          0,015; 0,016; 0,017

                          0,073; 0,076; 0,078

                          0,046; 0,044; 0,047

                          Концентрация 0,001 моль/л

                          CuSO4(крепыш)

                          0,020; 0,018; 0,024

                          0,022; 0,018; 0,022

                          0,096; 0,094; 0,099

                          CdSO4(крепыш)

                          0,036; 0,032; 0,042

                          0,012; 0,012; 0,010

                          0,002; 0,003; 0,004

                          Н2О (крепыш)

                          0,039; 0,034; 0,040

                          0,016; 0,015; 0,010

                          0,053; 0,052; 0,051

                          Н2О (щирица)

                          0,032; 0,034; 0,036

                          0,017; 0,016; 0,017

                          0,003; 0,005; 0,004

                          CuSO4(щирица)

                          0,024; 0,026; 0,029

                          0,008; 0,010; 0,009

                          0,056; 0,059; 0,060

                          CdSO4(щирица)

                          0,034; 0,024; 0,026

                          0,013; 0,016; 0,013

                          0,059; 0,065; 0,064

                          Концентрация 0,01 моль/л

                          CuSO4(крепыш)

                          0,020; 0,018; 0,016

                          0,002; 0,005; 0,002

                          0,084; 0,079; 0,082

                          CdSO4(крепыш)

                          0,024; 0,022; 0,021

                          0,004; 0,006; 0,004

                          0,034; 0,038; 0,040

                          Н2О (крепыш)

                          0,018; 0,015; 0,017

                          0,004; 0,005; 0,003

                          0,027; 0,029; 0,026

                          Н2О (щирица)

                          0,026; 0,024; 0,021

                          0,006; 0,009; 0,007

                          0,046; 0,041; 0,042

                          CuSO4(щирица)

                          0,014; 0,011; 0,010

                          0,008; 0,010; 0,011

                          0,032; 0,034; 0,030

                          CdSO4(щирица)

                          0,022; 0,023; 0,021

                          0,005; 0,003; 0,004

                          0,020; 0,015; 0,022

                          По завершению работы были составлены диаграммы, в которых отображены результаты исследований, а именно влияние растворов солей тяжелых металлов на культурный и дикорастущий виды амаранта. Проанализируем их.

                          Рисунок 3.1 − Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш (А) при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л.

                          Рисунок 3.2 − Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян щирицы запрокинутой при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л.

                          В соответствие с рисунками 3.1 и 3.2 выявлено, что раствор сульфата кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш  на 16% при проращивании их в течении суток  (по сравнению с контролем). Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем, на 8,7 %.

                          При интоксикации семян исследуемыми растворами в течение трех суток установлено, что раствор сульфата кадмия снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 4,8 % , а у семян щирицы снижается на 6,6 %.

                          На пятые сутки проращивания значение удельной активности фермента семян амаранта практически сходно с контролем. Так, раствор сульфата кадмия снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 2,6% , а удельную активность каталазы семян щирицы на 1,8 %.

                          Раствор сульфата меди с концентрацией 0,0001 моль/л также снижает удельную активность каталазы при проращивании семян в течение одних суток. Отмечено уменьшение удельной активности каталазы семян амаранта сорта Крепыша на 19,2%, а семян щирицы на 9,8% по сравнению с контролем.

                          Обработка семян амаранта этим раствором в течение трех суток изменяет удельную активность каталазы семян амаранта сорта Крепыш всего лишь на 6,9%, а семян щирицы на 5%.

                          На пятые сутки исследования отмечено, что удельная активность каталазы проростков практически схожа с контролем. Так, раствор сульфата меди снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 5% а семян щирицы на 4%.

                          Кроме того, в ходе исследования отмечено, что вышеназванные растворы практически не влияли на развитие проростков: семена прорастали с одинаковой скоростью.

                          Таким образом, можно сделать вывод, что происходит постепенная адаптация проростков к воздействию растворов сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,0001 моль/л, так как удельная активность каталазы прорастающих семян приближается к контролю.

                          Семена щирицы лучше адаптируется к стрессу. Также не отмечено влияние природы металлов на адаптацию.

                          Рисунок 3.3 − Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш (А) при интоксикации растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 моль/л.

                          Рисунок 3.4 −  Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян щирицы при интоксикации расторами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 моль/л.

                          Анализ рисунков 3.3 и 3.4 показывает, раствор сульфата кадмия с концентрацией 0,001 моль/л снижает удельную активность каталазы при проращивании их в течении одних суток на 31% по отношению к контролю. Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем на 25,5 %. Проращивание семян в течение трех суток в растворе сульфата кадмия вызывает снижение удельной активности семян амаранта сорта Крепыш на 15,2 % , а щирицы на 14,7 %. На пятые сутки интоксикации отмечено, что удельная активность прорастающих семян щирицы меньше отличается от контроля (на 5,5%) чем у крепыша (на 12,9%). Что также может свидетельствовать о большей устойчивости дикорастущего вида.

                          Раствор сульфата меди с концентрацией 0,001 моль/л также снижает удельную активность каталазы. Удельная активность каталазы в прорастающих семенах амаранта сорта Крепыш по сравнению с контролем падает на 35,6%,  а у проростков щирицы снижается на 28,4 % при проращивании в течение одних суток. При проращивании семян в течение трех суток в растворе сульфата меди(II) удельная активность семян амаранта сорта Крепыш снижается на 21,1 % , а у щирицы - на 18,2 %. На пятые сутки исследования отмечено, что в растворе сульфата меди удельная активность прорастающих семян амаранта сорта Крепыш снижается на 17,4%, а у семян щирицы на 7,1 %.

                          Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что прорастающие семена Крепыша не адаптируются к стрессорам. Также, не происходит адаптации к стрессорам и у семян щирицы.Исследования показали, что прорастание семян в растворах сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,001 /л идет дольше, но при этом лучшие результаты отмечены у семян щирицы.

                          Рисунок 3.5 − Изменение удельной активности каталаз прорастающих семян амаранта сорта Крепыш при интоксикации их растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,01 моль/л.

                          Рисунок 3.6 − Изменение удельной активности каталазы прорастающих семян щирицы при интоксикации их растворами сульфатов меди(II) и кадмия с концентрацией 0,01 моль/л.

                          В соответствие с анализом рисунков 3.5 и 3.6 выявлено, что более концентрированный раствор сульфата кадмия (0,01 моль/л) снижает удельную активность каталазы семян амаранта сорта Крепыш на 50 % по отношению к контролю при интоксикации семян в течение суток. Активность каталазы проростков щирицы также падает по сравнению с контролем, на 49,6 %. На третьи сутки проращивания отмечена адаптация, раствор сульфата кадмия снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 43 % , а амаранта сорта щирица превышает удельную активность каталазы на 1,4%. На пятые сутки раствор сульфата кадмия снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш на 44,1% , а у щирицы на 43 %.

                          Раствор сульфата меди также снижает удельную активность. Удельная активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш в течение одних суток по сравнению с контролем падает на 53,7 %, а удельная активность каталазы проростков щирицы снижается на 52,7%. На третьих сутках раствор сульфата меди снижает удельную активность семян амаранта сорта Крепыш на 52,7 % , а амаранта сорта Щирица повышает на 4,6 %. На пятые сутки семяна практически не прорастают. Так, раствор сульфата меди снижает удельную активность каталазы прорастающих семян амаранта сорта Крепыш 48,7% и снижает удельную активность семян сорта Щирица на 48 %.

                          Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что прорастающие семена Крепыша не адаптируются к стрессорам.

                          Также, не происходит адаптации к стрессорам и у семян щирицы, так как, несмотря на то, что удельная активность каталазы превышает контроль, на пятые сутки отмечается резкое падение удельной активности по отношению к контролю. Согласно закону Селье, это может свидетельствовать об истощении организма в целом.

                          ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ 4

                          1 Исследовано влияние растворов сульфатов меди(II) и кадмия на удельную активность каталаз прорастающих семян амаранта в зависимости от концентрации и от продолжительности воздействия стрессоров. Отмечен сходный характер влияния сульфатов на удельную активность каталазы проростков амаранта, наблюдается угнетающее действие.

                          2 Установлена различная устойчивость каталаз прорастающих семян Крепыша и щирицы к действию данных стрессоров. Дикорастущий вид лучше адаптируется к стрессорам по сравнению с культурным сортом.

                          СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

                          1. Алексеев, Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях / В. Ю. Алексеев. − Л.:Агропромизд., 1987. – 142 с.
                          2. Алехина Н.Д. Физиология растений. Учебник для студентов вузов./Н.Д. Алехина, Ю.В. Балнокин, В.Ф. Гавриленко и др ‒ М.: Издательский центр «Академия», 2005, 640 с.
                          3. Анисимов. А. А. Основы биохимии: Учебник для студентов биологической специальности университетов / А. А. Анисимов, А. Н. Леонтьева, И. Ф. Александрова и др. ; под общ. ред. А. А. Анисимова. – М. : Высшая школа, 1986. – 551
                          4. Варфоломеева С. Д. Химическая энзимология / С. Д. Варфоломеева. – М.: Академия, 2005. – 480с.
                          5. Гусев, В.Д. Обзор родаAmaranthus в СССР : Амарант в СССР : [пер. с англ.] / В.Д. Гусев. – Ботанический журнал, Т.57, №5, 1972.-457-464 с.
                          6. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. – М. : Иностранная литература, 1996. – 814 с
                          7. Ежедневный познавательный журнал [Электрон. ресурс] – Режим доступаhttp://shkоlаzhizni.ru/wоrld/аrtiсlеs/16618/ - 25.12.17.
                          8. Ермолаев М. В. Биологическая химия / М. В. Ермолаев. – М. : Медицина, 1983. – 288с.
                          9. Жизнь растений. В 6−ти т. Гл. ред. чл. кор. АН СССР, проф. Федоров, А. А. Т. 2. Грибы. Под.ред. проф. Горленко, М. В. / М. В. Горленко. – М.: Просвещение, 1976. – 479 с.
                          10. Иванов, В.Б. Сравнение влияния ТМ на рост корня в связи с проблемой специфичности и избирательности их действия / В.Б. Иванов, Е.И. Быстрова,  И.В. Серегин // Физиология растений. – 2003. – 454 с.
                          11. Иванова, Елена Михайловна. Токсическое действие меди и механизмы ее детоксикации растениями рапса: диссертация кандидата биологических наук / Иванова Елена Михайловна, 2005 – 125 с.
                          12. Иваченко, Л.Е. Методы изучения полиморфизма ферментов сои: учебное пособие / под редакцией Л. Е. Иваченко [и др.]. – Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2008. – 142 с
                          13. Ильин, В.Б. Тяжелые металлы в системе почва – растения / В. Б. Ильин,И. Л. Илевенская. – Новосибирск : Наука. 1991. − 148 с.
                          14. Кадмий [Электрон. ресурс] – Режим доступаhttp://www.pharmacognosy.com.ua/index.php/makro-i-mikro-chudesa/kadmiy-ubijtsa-immuniteta-ili-stimulator-rosta/kadmiy-dlya-rasteniya-razrushitel – 23.12.17.
                          15. Карапетьянц, М.Х.Общая и неорганическая химия / М.Х. Карапетьянц, С.И. Дракин - М.: Химия, 1992. – 125c.
                          16. Классификация ферментов [Электрон. ресурс] – Режим доступаhttp://5ка.рф/catalog/view.download/33/1956- 20. 03.18.
                          17. Медведев С.С. Физиология растений: Учебник. – СПб.: Изд-во С.- Петерб. ун-та, 2004. – 336 с.
                          18. Меры безопасности при работе с химическими веществами и оказание первой доврачебной помощи [Электрон. ресурс]. – Режим доступа

                          http://toxi.dyndns.org/Spravki/medical_help/med_help/Medical.pdf – 25.12.2017.

                          1. Петров, Б.А. Минеральное питание растений. Справочное пособие для студентов и огородников/ Б.А. Петров, Н.Ф. Селиверстов: Екатеринбург, 1998. –79с.
                          2. Полевой В.В. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. – М.: Высш. шк., 1989. – 464 с.
                          3. Пятыгин, С.С. Стресс у растений: физиологический подход Журнал общей биологии / Пятыгин, С.С., 2008 – 298 с. - 20.12.17.
                          4. Свойства ферментов[Электрон.ресурс] – Режим доступа ,http://dendrit.ru/page/show/mnemonick/svoystva-i-klassifikaciya-fermentov/ - 24.12.17.
                          5. Селье Г. На уровне целого организма. М.: Наука, 1990, 212 с.
                          6. Трофимцова И.А.Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. Материалы ХII международной конференции (Ялта, 6-10 июня 2016г.). (ВНИИССОК), Ялта, 2016.№ 12. С. 154-157. (РИНЦ)/ Трофимцова И.А, Мартыненко Н.В , 2016 – 154 – 157с.
                          7. Тяжелые металлы как фактор экологической опасности: Методические указания к самостоятельной работе по экологии для студентов 3 курса дневной формы обучения / Составитель: Ю.А. Холопов. – Самара:СамГАПС, 2003. – 16 с.
                          8. Удивительный мир растений [Электрон.ресурс] -http://www.valleyflora.ru/fermenty-i-prevrashcheniye-veshchestv.html - 20.05.18.
                          9. Усманов И.Ю., Рахманкулова З.Ф., Кулагин А.Ю. Экологическая физиология растений: Учебник. – М.: Логос, 2001. – 224 с
                          10. Фитопатология / П.Н.Головин, М.В. Арсеньева, З.Н. Халеева, З.И. Шестиперова; Под ред. М.В. Горленко. – Л.: Колос. Ленингр. отд-ние, 1980. – 319 с.
                          11. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы: пер. с англ. / П. Фридрих. – М. : Мир, 1986. – 374 с.
                          12. Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений: Учебное пособие. Изд. С.-Петерб. ун-та, 2002, 240 с.
                          13. Ягодин, Б.А. Агрохимия / под редакцией Б.А. Ягодина [и др.]. – М.: Колос, 2002. – 584 с.

                          ПРИЛОЖЕНИЕ А

                          Рисунок 1 - График зависимости содержания белка в пробе (мг) от

                          показателя преломления




                          Похожие работы, которые могут быть Вам интерестны.

                          1. УСТОЙЧИВЫЕ ВИДЫ И СОРТА ХВОЙНЫХ ПОРОД В ЛАНДШАФТНОМ ДИЗАЙНЕ

                          2. Концентрация растворов

                          3. Аптечная технология растворов для внутреннего применения

                          4. РЕЗУЛЬТАТЫ МОДИФИКАЦИИ БЕНТОНИТОВЫХ РАСТВОРОВ ДЛЯ БЕСТРАНШЕЙНОЙ ПРОКЛАДКИ КОММУНИКАЦИЙ

                          5. Физико-химия поверхностных явлений, дисперсных систем и растворов ВМС

                          6. КОРНЕВЫЕ ГНИЛИ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (PinussylvestrisL.) В НИЖНЕМ ПРИКАМЬЕ И МЕРЫ ПО СНИЖЕНИЮ ИХ ВРЕДОНОСНОСТИ

                          7. Факторы влияния на электоральную активность

                          8. Проект испытательных культур плюсовых деревьев сосны обыкновенной в Кададинском лесничестве Пензенской области

                          9. Двигательная активность детей старшего дошкольного возраста

                          10. Оценка рыночной стоимости одной именной обыкновенной бездокументарной акции акционерного общества «Стрела» в составе 100% пакета акций