Изучение и сравнительная оценка действия низкоинтенсивного широкополосного света красного диапазона на оксидативные процессы в тканях крыс



ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений………………………………….………..……………….….6

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………….…….………7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологическое действие электромагнитного излучения видимого

спектра на биологические объекты…………..……………….…..……..15

1.1.1. Физико-химическое действие низкоинтенсивного света красного

диапазона на биологические объекты …………………..………………17

1.1.2. Влияние низкоинтенсивного света на органы и ткани человека и

животных при их альтерации …………………..……...…………...……31

1.1.3. Эффекты воздействия низкоинтенсивного света синего, зеленого и

желто-оранжевого диапазонов на органы и ткани человека и животных

при их альтерации………………………………………..……………….41

1.2. Свободнорадикальное окисление

1.2.1. Механизм перекисного окисления липидов…………...………………..49

1.2.2. Механизм окислительной модификации белков…..…..……….………55

1.2.3. Антиоксидантная система………………………………..……..………..69

1.2.4. Патологические изменения, индуцируемые перекисным окислением

липидов и окислительной модификацией белков….…………….……..73

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Постановка опыта и объект исследования………….……………………..89

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение степени окислительной модификации белков по уровню

карбонильных производных………………………………….…………………93

2.2.2. Определение общего белка биуретовым методом……….……………..94

2.2.3. Исследование уровня перекисного окисления липидов с помощью

определения содержания ДК, ТК и ОШ……………………….…………….…94

2.2.4. Определение активности ГSТ……..……………………...………….…..95

2.2.5. Анализ электрической активности сердца крыс……………..…………96

3

2.2.6. Электронно-микроскопический анализ…………………………….……96

2.3.Статистическая обработка результатов…………………………...…..……96

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Альтерация сердечной и легочной ткани крыс гамма-излучением при

последующем воздействии низкоинтенсивным широкополосным красным

светом

3.1.1. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

электрическую активность сердца крыс после воздействия ионизирующей

радиацией на область сердца……………………………………………………98

3.1.2. Эффекты воздействия широкополосного красного света на спонтанную

окислительную модификацию белков в сердечной, легочной тканях и

сыворотке крови крыс после воздействия ионизирующей радиацией на

область сердца………………………………………………….………………104

3.1.3. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

индуцированную окислительную модификацию белков в сердечной,

легочной тканях и сыворотке крови крыс после воздействия ионизирующей

радиацией на область сердца…………………………………………………..122

3.1.4. Эффекты воздействия широкополосного красного света на перекисное

окисление липидов в сердечной, легочной тканях и сыворотке крови крыс

после воздействия ионизирующей радиацией на область сердца……..……140

3.1.5. Эффекты воздействия широкополосного красного света на активность

ГSТ в сыворотке крови крыс после воздействия ионизирующей радиацией на

область сердца………………………………………………………………….146

3.1.6. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

функциональную активность сердечной ткани крыс после воздействия

ионизирующей радиацией на область сердца…………………………...……149

3.2. Альтерация мышечной ткани крыс гамма-излучением при последующем

воздействии низкоинтенсивным широкополосным красным светом

4

3.2.1.

Эффекты

воздействия широкополосного красного света на

спонтанную окислительную модификацию белков в мышечной ткани крыс

после

воздействия

ионизирующей

радиацией…………………………………………………….………………....155

3.2.2. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

индуцированную окислительную модификацию белков в мышечной ткани

крыс после воздействия ионизирующей радиацией………………..………..162

3.2.3. Эффекты воздействия широкополосного красного света на перекисное

окисление липидов в мышечной ткани крыс после воздействия

ионизирующей радиацией……………………………………………………..166

3.2.4. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

функциональную активность мышечной ткани крыс после воздействия

ионизирующей радиацией……………………………………………………..169

3.3. Альтерация мышечной ткани крыс высокоинтенсивными лазерами при

последующем воздействии низкоинтенсивным широкополосным красным

светом

3.3.1. Сравнительные эффекты воздействия широкополосного красного света

на спонтанную окислительную модификацию белков после облучения

мощными лазерами инфракрасного и красного спектра…………………….176

3.3.2. Сравнительные эффекты воздействия широкополосного красного света

на индуцированную окислительную модификацию белков после облучения

мощными лазерами инфракрасного и красного спектра………………….…186

3.3.3. Сравнительные эффекты воздействия широкополосного красного света

на перекисное окисление липидов после облучения мощными лазерами

инфракрасного и красного спектра………………………………………...….195

3.3.4. Сравнительные эффекты воздействия широкополосного красного света

на активность ГST после облучения мощными лазерами инфракрасного и

красного спектра………………………………………………………………..201

3.3.5. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

функциональную активность мышечной ткани крыс после облучения

мощным лазером красного спектра…………………………………………...204

5

3.4 Альтерация сердечной и легочной ткани крыс наложением асфиксии при

последующем воздействии низкоинтенсивным широкополосным красным

светом

3.4.1. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

электрическую активность сердца крыс при наложении асфиксии……..….207

3.4.2. Эффекты воздействия широкополосного красного света на спонтанную

окислительную модификацию белков при наложении асфиксии…………..211

3.4.3. Эффекты воздействия широкополосного красного света на металл

катализируемую окислительную модификацию белков при наложении

асфиксии………………………………………………………………………...222

3.4.4. Эффекты воздействия широкополосного красного света на перекисное

окисление липидов при наложении асфиксии……………………….……….234

3.4.5. Эффекты воздействия широкополосного красного света на активность

ГST при наложении асфиксии…………………………………………………240

ВЫВОДЫ…………………………………………………………...…………..244

Список литературы……………………………………………………………..246

Приложение………………………………………………………………….….335

6

Список сокращений

2,4-ДНФГ – 2,4-динитрофенилгидразин

АКМ – активированные кислородные метаболиты

АОС – антиоксидантная система

АФК – активные формы кислорода

ГSТ – глутатион-s-трансфераза

ДК – диеновые конъюгаты

МДА – малоновый диальдегид

ОМБ – окислительная модификация белков

ОШ – основания Шиффа

ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СОД – супероксиддисмутаза

СРО – свободнорадикальное окисление

ТК – триеновые конъюгаты

ЧСС – частота сердечных сокращений

ЭКГ – электрокардиограмма

Hb – деоксигемоглобин

HbO2 – оксигемоглобин

In – радикал-ингибитор

7

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время в медицине все более широкое применение находит

воздействие на ткани и органы низкоинтенсивными электромагнитными

излучениями. При этом многочисленные исследования по воздействию

низкоинтенсивного света показывают, что данный тип излучения обладает

способностью влиять на функциональное состояние тканей и органов, а

также на организм в целом (Владимиров и др., 2004, Калинина и др., 2011;

Кару, 2005, 2008; Кобзева, 2013; Лаврушина, Топурия, 2007, 2008; Миронова,

Физюкова, Соломатина, 2014; Монич и др., 2010, 2011; Петрищев, Зубов,

Дементьева, 2011, Утц, Галкина, Райгородский, 2013; Buravlev et al., 2013;

Fiksdal, Tryland I., 1999; Machneva et al., 2008).

В литературе имеются сведения о влиянии низкоинтенсивного

лазерного излучения на регенерацию тканей после их альтерации

различными факторами (Букатый и др., 2007; Бурдули, Балаян, 2013; Жуков,

Кукольникова, 2011; Кару, 1986, Мачнева и др., 2013; Сутягина и др., 2013;

Tafur, Mills, 2008). В то же время, исследованию эффектов воздействия

широкополосного низкоинтенсивного света уделено гораздо меньше

внимания, хотя многими авторами показано отсутствие зависимости

биологического эффекта от когерентности излучения (Барабаш и др., 1996;

Монич, Шахов, Воробьев, 1994; Ульянов, Ульянова, 2010; Ernst, Fialka-

Moser, 1993; Schuhfried, Korpan, Fialka-Moser, 2000). При этом известно, что

стимулирующие эффекты лазерного излучения происходят только в узком

интервале терапевтических доз, при высоких отмечается гиперактивация, при

сверхвысоких – ингибиция функций органов и тканей (Гуляр, 1999; Зверева,

Грунина, 1996; Кондратьев, Михайлова, Петрищев, 2013; Петрищев,

Янтарева, Фокин, 2005; Послов, 2002; Элькина и др., 1990; Ernst, Fialka-

Moser, 1993).

Не изученными остаются особенности эффектов воздействия

низкоинтенсивного широкополосного света на процессы восстановления

8

физиологических функций тканей и органов

после

гипоксии,

обусловленной наложением асфиксии и облучения высокоинтенсивным

лазерным излучением. Гипоксия, ишемия и такие физические факторы, как

ионизирующее и высокоинтенсивное неионизирующее излучения способны

вызвать патологические изменения в облучаемых органах и тканях,

обусловленные накоплением активных форм кислорода, ингибированием

ферментативной антиоксидантной системы и, как результат, оксидативным

стрессом.

Одними из ключевых механизмов фотобиологического действия

низкоинтенсивного света является фотомодификация активности ферментов,

в том числе, антиоксидантных, и фотодиссоциация нитрозильных

комплексов (Владимиров и др., 2004, Кару, 1999), что приводит к

снижению содержания продуктов свободнорадикального окисления в

исследуемых

тканях.

Поэтому

изучение

содержания

продуктов

свободнорадикального окисления в изучаемых объектах может послужить

универсальным методом исследования степени альтерации и восстановления

тканей и органов, а также организма в целом.

Вместе с тем, исследована роль не всех звеньев ферментативной

регуляции окислительных процессов в развитии каскада фотохимических

процессов. Интерес представляет изучение возможности модификации

активности фермента глутатион-s-трансферазы (ГST). Не раскрытой

представляется также картина морфологических альтераций происходящих в

клетках мышечных тканей при развитии оксидативного стресса и в ходе

компенсации его последствий.

Цель исследования:изучение и сравнительная оценка действия

низкоинтенсивного широкополосного света красного диапазона на

оксидативные процессы в тканях крыс, активность фермента ГST и

ультраструктуру клеток мышечных тканей после их альтерации различными

физическими факторами (гамма-излучением, лазерным излучением красного

и инфракрасного диапазона высокой мощности) и наложением асфиксии.

9

Задачи исследования:

1. Определить изменение активности ГSТ в сыворотке крови крыс,

вызванное воздействием высокоинтенсивным ионизирующим и

неионизирующим излучением, а также влиянием гипоксии и

последующим облучением низкоинтенсивным широкополосным

красным светом.

2. Исследовать влияние высокоинтенсивного лазерного излучения

красного и инфракрасного диапазонов на микроструктуру и

функциональное состояние поперечнополосатой скелетной мышечной

ткани и миокарда и выявить особенности альтераций внутренних

органов,

вызываемых

электромагнитными

излучениями

этих

диапазонов.

3. Изучить возможность компенсации альтераций микроструктуры и

функционального состояния поперечнополосатой скелетной мышечной

ткани

и

миокарда,

вызванных

ионизирующей

радиацией,

высокоинтенсивным лазерным излучением красного и инфракрасного

диапазонов и наложением асфиксии с помощью локального

воздействия на соответствующие органы и ткани низкоинтенсивным

широкополосным красным светом.

4. Изучить влияние низкоинтенсивного широкополосного красного света

на процессы окислительной модификации белков (ОМБ) в скелетной

мышечной, сердечной и легочной тканях, а также в сыворотке крови

крыс после облучения ионизирующей радиацией, высокоинтенсивным

лазерным светом и наложения асфиксии.

5. Изучить влияние низкоинтенсивного широкополосного красного света

на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в скелетной

мышечной, сердечной и легочной тканях, а также в сыворотке крови

крыс после воздействия на организм крыс вышеперечисленными

факторами.

6. Изучить влияние низкоинтенсивного широкополосного красного света

на электрическую активность сердца крыс после воздействия на

10

проекционную область сердца ионизирующей

радиацией

и

наложения асфиксии.

Научная

новизна.

Изучено

влияние

низкоинтенсивного

широкополосного электромагнитного излучения видимого диапазона на

функциональное состояние тканей, органов и организма в целом после

альтерации различными физическими факторами.

Установлено, что широкополосный красный свет повышает

активность антиоксидантной системы, в частности, активность ГST в

сыворотке крови животных, подвергшихся облучению ионизирующей

радиацией, лазерным излучением высокой мощности и наложению

асфиксии.

Проведено

исследование

процессов

свободнорадикального

окисления (ОМБ и ПОЛ) и активности ГSТ в различных тканях крыс при

развитии

поражений,

вызванных

ионизирующей

радиацией,

високоинтенсивным лазерным излучением красного и инфракрасного

спектра и наложением асфиксии.

Выявлено сходство и различие действия лазерного излучения

высокой мощности красного и инфракрасного диапазона на процессы

свободнорадикального окисления и активность ГSТ в тканях

лабораторных животных и дана сравнительная характеристика.

Показано корректирующее влияние широкополосного красного

света на скорость образования промежуточных продуктов и накопления

конечных продуктов ОМБ в сердечной и легочной тканях, а также

сыворотке крови крыс при развитии радиационно-индуцированной

болезни сердца и при коррекции последствий асфиксии.

Выявлено

восстанавливающее

действие

низкоинтенсивного

электромагнитного излучения видимого диапазона на содержание

продуктов ПОЛ в сердечной и легочной тканях, а также сыворотке крови

крыс при развитии лучевого поражения сердца и после наложения

асфиксии.

11

Показана

нормализация содержания

промежуточных

и

конечных продуктов свободнорадикального окисления (ОМБ и ПОЛ) в

мышечной ткани крыс, подвергшихся облучению гамма-излучением и

высокоинтенсивным лазерным излучением красного и инфракрасного

диапазона под действием низкоинтенсивного широкополосного света.

Исследованы

эффекты

воздействия

низкоинтенсивного

широкополосного электромагнитного излучения видимого диапазона на

ультраструктуру скелетной и сердечной мышечной ткани крыс при

коррекции нарушений, вызванных ионизирующей радиацией и лазерным

излучением высокой мощности. Воздействие низкоинтенсивным

красным светом способствовало восстановлению сократительной

функции скелетной мышцы и миокарда, предотвращению деструкции

митохондрий и дилатации саркомеров.

Выявлено,

что

облучение

проекционной

зоны

сердца

широкополосным

красным

светом

может

компенсировать

патологические изменения характеристик сердечной деятельности и

крыс, подвергавшихся воздействию гамма-излучением и наложению

асфиксии.

Теоретическая и практическая значимость работы.Работа

выполнена в соответствии с плановым НИР кафедры медицинской

физики

и

информатики

НижГМА.

Исследование

является

фундаментальным теоретическим исследованием с перспективным

практическим выходом.

Проведенные

исследования

углубляют

представления

о

нарушениях процессов свободнорадикального окисления и активности

ферментативной защиты, происходящих в организме при альтерации

различными факторами, такими как ионизирующая радиация,

высокоинтенсивное лазерное излучение и асфиксия.

Полученные данные расширяют представление о действии

низкоинтенсивных электромагнитных излучений видимого диапазона на

12

функциональное

состояние различных

тканей,

органов

и

организма в целом при их альтерации. Результаты исследований

позволяют разработать практические методы коррекции нарушений,

вызванных вышеперечисленными факторами и внедрить их в

физиологическую и медицинскую практику.

В результате проведенных исследований установлены особенности

влияния лазерного излучения высокой мощности красного и

инфракрасного диапазона на физиологическое состояние мышечной

ткани и организма в целом.

Таким образом, применение низкоинтенсивного широкополосного

красного света имеет большие перспективы при практическом

использовании в качестве терапевтического фактора, способного

восстанавливать поврежденные ткани на молекулярном уровне в

различных областях: в онкологической практике, хирургии и других

направлениях медицины.

Положения, выносимые на защиту.

1. Фермент ГST является одним из ключевых компонентов отклика

биологических тканей на низкоинтенсивное световое воздействие.

2. Широкополосный красный свет стимулирует активацию ГST после

альтерации тканей гамма-излучением, высокоинтенсивным лазерным

светом и наложением асфиксии.

3. Широкополосный красный свет модифицирует ультраструктуру

скелетной мышечной ткани и миокарда: способствует увеличению

количества митохондрий и восстановлению их структуры;

обеспечивает снижение внутриклеточного отека и появление

значительного

количества

гранул

гликогена;

вызывает

восстановление ядрышек, а также дилатацию миофибрилл, при этом

ширина

саркомеров

миосимпластов

соответствует

ширине

саркомеров в норме. Морфологические изменения, происходящие в

ультраструктуре мышечных тканей, показывают локализацию

13

структур,

обеспечивающих отклик живой ткани на световое

воздействие.

4. Широкополосный красный свет снижает уровень продуктов ПОЛ в

миокарде, скелетной мышце, легких и сыворотке крови после

воздействия

ионизирующей

радиацией,

высокоинтенсивным

лазерным излучением красного и инфракрасного диапазона, а также

после наложения асфиксии.

5. Широкополосный красный свет нормализует скорость образования

промежуточных продуктов и накопления конечных продуктов ОМБ в

тканях крыс после воздействия вышеперечисленными стресс-

факторами.

6. Облучение высокоинтенсивным лазерным излучением красного и

инфракрасного диапазона приводит к активации процессов

образования продуктов ОМБ и ПОЛ не только в непосредственно

облученных образцах мышечной ткани, но и в сыворотке крови, что

свидетельствует об общем ослаблении организма в результате

локального воздействия лазерным излучением высокой мощности.

7. Существуют различия в молекулярном ответе живых организмов на

воздействие высокоинтенсивным лазерным излучением красного и

инфракрасного диапазона: воздействие лазерным светом красного

диапазона вызывает более выраженные локальные реакции,

воздействие лазера инфракрасного диапазона приводит к более

общим (общеорганизменным) ответным реакциям.

8. Облучение широкополосным красным светом проекционной области

сердца после воздействия ионизирующей радиацией и наложения

асфиксии приводит к восстановлению его электрической активности.

Апробация работы.Основные положения работы были доложены и

обсуждены на Х Международной научно-практической конференции

«Современная техника и технологии в медицине, биологии и экологии»

(Новочеркасск, 2010), на III Евразийском конгрессе по медицинской физике и

инженерии «Медицинская физика – 2010» (Москва, 2010), на конференции

14

молодых

ученых

«Механизмы адаптации физиологических систем

организма к факторам среды» (Санкт-Петербург, 2010), на конференции

Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE «Mechanisms

for Low-Light Therapy V» (USA, San Francisco, 2010), на II Всероссийской

научно-практической конференции «Проблемы современной медицины:

актуальные вопросы и перспективы развития» (Москва, 2011), на X Научной

сессии молодых учёных и студентов «Современное решение актуальных

научных проблем в медицине» (Нижний Новгород, 2011), IV съезде

биофизиков России, симпозиуме III «Физика – медицине и экологии»

(Нижний Новгород, 2012), на IV съезде биофизиков России, симпозиуме II

«Физические основы физиологических процессов» (Нижний Новгород,

2012), на Международной заочной научно-практической конференции

«Биология, химия, физика: теоретические и практические аспекты»

(Новосибирск,2012), на XII международной научно-практической

конференции «Естественные и математические науки в современном мире»

(Москва, 2013).

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, их них 16 – в

изданиях, рекомендуемы перечнем ВАК МО РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 334

страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы,

материалов и методов собственных исследований, обсуждения результатов,

выводов, списка литературы, включающего 689 источников, из которых 494

отечественных и 196 иностранных, и приложения. Диссертация

иллюстрирована 10 таблицами и 137 рисунками.

15

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Физиологическое действие электромагнитного излучения

видимого спектра на биологические объекты

Видимое излучение – электромагнитные волны, воспринимаемые

человеческим глазом, которые занимают участок спектра с длинами волн

приблизительно от 380 (фиолетовый) до 780 нм (красный) (ГОСТ 7601-28;

Bruno, Svoronos, 2005). Электромагнитное излучение с такими длинами волн

также называется видимым светом, или просто светом (Иофис, 1981).

При разложении луча белого цвета в призме образуется спектр, в

котором излучения разных длин волн преломляются под разным углом.

Цвета, входящие в спектр, то есть такие цвета, которые могут быть получены

световыми волнами одной длины (или очень узким диапазоном), называются

спектральными цветами. Согласно T.J. Bruno, P.D.N. Svoronos (2005)

видимый свет подразделяется на следующие спектральные цвета:

-фиолетовый (380-440 нм);

-синий (440-485 нм);

-голубой (485-500 нм);

-зеленый (500-565 нм);

-желтый (565-590 нм);

-оранжевый (590-625 нм);

-красный (625-740 нм).

Видимый свет нашел широкое применение в области клинической

практики, называемой фотомедицина, в качестве физиологического агента.

При этом необходимо отметить спектральную зависимость действия

света на биологические ткани. Ультрафиолетовые лучи полностью

поглощаются в эпидермисе, синий и зеленый свет – в дерме. В более

глубокие слои проникают только красный свет и ближнее инфракрасное

излучение в диапазоне 800-1000 нм. (Манина, Улащик, Куклова, 2010).

16

Длина

волны монохроматического

света

определяет глубину его проникновения в ткани. В диапазоне длин волн

больше 650-1200 нм наблюдается оптическая прозрачность биотканей

(Muller, Wilson, 1986).

На сегодняшний день неоспоримым фактом является специфичность

биологического воздействия каждого спектра видимого излучения, учитывая

избирательное поглощение электромагнитного излучения различных длин

волн

соответствующими

фотоакцепторами

биологических

тканей

(Веселовский, Кирьянова, Митрофанов, 2001).

Для уточнения воздействия цвета на основе биолокационных и

биорезонансных технологий предложена био-кибернетическая модель тела

человека, в которой все системы, органы и ткани удалось объединить в 13

классификационных групп, для каждой из которых соответствует своя

резонансная частота цветового спектра:

– для кожи и ее производных (волосы, ногти, молочные железы, клетчатка)

760 нм (темно-красный цвет);

– для костей, суставов, связок, дисков и позвонков 686 нм (красный цвет);

– для сосудов (артерии и вены), сердца, мышц (поперечнополосатых и

гладких) 656 нм (оранжево-красный цвет);

– для таких органов тела человека, как кровь, селезенка (красная пульпа),

красный костный мозг (как орган кроветворения) 589 нм (оранжевый цвет);

– для толстой кишки с ее отделами (слепая, восходящая, нисходящая,

поперечно-ободочные, прямая) и желудка, если он содержат много

мышечных элементов, 585 нм («золотой» цвет);

– для тонкой кишки, включая 12-ти перстную, тощую и подвздошные

отделы, поджелудочную железу (ее экзокринную часть), слюнные железы и

пищевод 580 нм (желтый цвет);

17

– для органов половой системы (матка, яичники у женщин, яички у

мужчин и простата, семенные пузырьки) 565 нм (желто-зеленый цвет);

– для печени и желчного пузыря 527 нм (зеленый цвет);

– для почек, мочевого пузыря, мочеточников частота 517 нм (голубовато-

зеленый цвет);

– для органов иммунной защиты (вилочковая железа, селезенка, лимфоузлы),

слизистой полости носа и бронхов 486 нм (голубой цвет);

– для органов нейро-эндокринной регуляции (щитовидной железы,

надпочечников, половых желез, гипофиза, гипоталамуса, эпифиза) 430 нм

(синий цвет);

– для вегетативной (симпатической, парасимпатической) и периферической

нервной систем, проприо-рецепторам и физиологическим анализаторам (глаз,

ухо, вестибулярный аппарат) 397 нм (фиолетовый цвет);

– для проблем с мозгом и психикой 380 нм (темно-фиолетовый цвет) (Бут,

Бут, 2004).

Пороговая доза облучения, необходимая для запуска тех или иных

клеточных

биохимических

процессов,

также

является

строго

индивидуальной для каждого спектра видимого излучения (Гейниц,

Москвин, 2010).

1.1.1. Физико-химическое действие низкоинтенсивного света красного

диапазона на биологические объекты

Исходя из литературных данных, в медицине наиболее широко

используется красный свет, способный проникать на глубину 3,5 мм

(Дуплик, 1990) и воздействовать на различные ткани органы.

На

сегодняшний

день

многочисленные

данные

литературы

свидетельствуют о сходстве действия на биологические объекты лазерного

излучения с излучением некогерентных и неполяризованных светодиодов

18

(Клебанов и др., 2006; Лобко, Кару, Лехотов, 1985; Шехтер и др., 2004;

Шейко и др., 2004). Более того, С.С. Ульяновым и О.В. Ульяновой (2010)

проанализировано влияние пространственной и временной когерентности на

организм животных. На основе теоретических и экспериментальных

исследований установлено, что не существует никаких биофизических

предпосылок для того, чтобы когерентность света могла бы оказывать

влияние на живые системы различного уровня, а действие лазерного

излучения могло бы являться специфическим.

В то же время использование некогерентного монохромного излучения

дает возможность шире использовать позитивные моменты, отсутствующие

при других способах лечения (Монич, Монич, Малиновская, 1991). Прежде

всего, в отличие от узконаправленного лазерного пучка красный свет не

оказывает

деструктивного

воздействия

на

тканевые

элементы.

Альтернативой использованию лазера является использование светодиодных

матриц с максимумом в оранжево-красной области (Ablon, 2010; Oliveira,

2008) или источников белого света, излучение которых модулируется с

помощью специальных светофильтров (Монич, Малиновская, Монич, 1992;

Saczko et al., 2005).

Кроме того, определенным положительным моментом является и

экономическая составляющая, поскольку здесь не требуется дополнительная

аппаратура, что немаловажно в условиях практической медицины

(Евдокимов, Невзорова, Капитонова, 2006).

Также

следует

подчеркнуть,

что

стимулирующие

эффекты

наблюдаются только при терапевтических дозах лазерного излучения, при

высоких отмечается гиперактивация, при сверхвысоких – ингибиция (Гуляр,

1999).

Поэтому новый этап развития аппаратной фототерапии связан с

использованием светодиодов. Вначале в клиническую практику были

внедрены светодиоды монохроматического излучения в красной части

19

спектра (630–660 нм), позднее – в ближнем инфракрасном диапазоне

(860–890 мкм) (Кочетков, Турова, Искандарян, 2009).

Исходя из того, что применение лазеров имеет естественные

ограничения

(Александров, 2008), изучение

эффектов

действия

широкополосного света на биообъекты является актуальным.

Не смотря на сходство влияния когерентного и некогерентного

излучения, существуют некоторые отличия. В.А. Моничем, С.Л.

Малиновской и В.Н. Крыловым (2011) было проведено сравнение

эффективности воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения и

широкополосного красного света на цельную кровь и восстановление

вегетативных функций организма крыс, перенесших клиническую смерть в

результате острой массивной кровопотери. Показано, что низкоинтенсивное

лазерное излучение оказывает большее влияние на восстановление

артериального давления и резистентность эритроцитов, а широкополосный

красный свет – на количество эритроцитов и содержание гемоглобина в

крови животных.

Эксперименты О.В. Друговой (2001) на изолированном сердце крыс

показали наличие значимости когерентного характера лазерного излучения.

Однако такая значимость проявляется лишь при облучении тканей,

обладающих регулярными структурами с размерами порядка длины волны

видимого света. К ним можно отнести скелетные мышцы и миокард. Также

когерентность света вызывает формирование общей тенденции к

одновременности этих реакций и подавлению спонтанности их протекания

во множестве облучаемых клеток.

Существует мнение, что сила и характер воздействия видимого

излучения на биологические объекты зависит не от когерентности источника

света, а от типа поляризации излучения. Данный вывод сделан В.Ю.

Плавским и Н.В. Барулиным (2008) по результатам исследований

воздействия на эмбрионы осетровых рыб линейно поляризованного и

неполяризованного излучения светодиодного источника, а также линейно

20

поляризованного,

циркулярно поляризованного

и

неполяризованного

излучения

гелий-неонового

лазера.

При

этом

максимальный

стимулирующий

эффект

(на

размерно-весовые

характеристики и показатели жизнестойкости молоди рыб) наблюдался при

воздействии линейно поляризованного излучения; фотобиологический

эффект, индуцируемый в том же дозовом интервале светом естественной

поляризации (т.е. неполяризованным), значительно менее выражен;

стимулирующее действие циркулярно поляризованного излучения занимало

промежуточное положение.

Нередко для объяснения успешности терапевтического применения

лазеров отмечают важность когерентности и почти полной поляризации

лазерного излучения. Однако такие утверждения нельзя считать

обоснованными, поскольку всякое рассеянное в неоднородной аморфной

среде электромагнитное излучение уже не обладает ни когерентностью,

ни поляризацией, а видимое или инфракрасное излучение с длиной волны

до 2000

нм полностью

рассеивается

в поверхностных

тканях

(за

исключением глаз) на глубинах от долей до единиц миллиметра (Лукьянович

и др., 2009).

Известно, что существуют выделенные частоты электромагнитных

колебаний, способные вызывать резкие изменения в функционировании

органов и систем живого организма, так называемые биоэффективные

частоты (Узденский, 1999; Хабарова, 2002).

Существует несколько гипотез о механизме терапевтического действия

низкоинтенсивного электромагнитного излучения видимого диапазона.

В клетках млекопитающих фотоакцепторами в красной области

спектра являются каталаза, супероксиддисмутаза, цитохроомоксидаза,

молекулярный кислород (Борисова, Хорошилова, Булгакова, 2002;

Есауленко, Никитин, Васильева, 2003; Кару Т.Й., 2001), в высших растениях,

грибах и бактериях – фитохромы, играющие важную роль в

светорегулируемых процессах (Wagner et al., 2007). В 1983 году Н.Ф. Гамалея

21

и

соавт.

предположили существование

у

животных

определенной фоторегуляторной системы, подобной фитохромной системе

растений.

Существует мнение, что дыхательные цепи как эукариотических, так и

прокариотических клеток обладают светочувствительностью (Векшин, 1991;

Tafur, Mills, 2008). Так, облучение светом с длинами волн 602 нм, 632,8 нм,

650 нм и 725 нм увеличивает синтез АТФ в выделенных митохондриях

(Passarella, Casamassima, Molinari, 1994), ликвидируя дефицит энергии на

информационно-энергитическом уровне адаптационных реакций (Зубкова,

1996). Освещение светом с длиной волны 633 нм увеличивает мембранный

потенциал митохондрий и протонный градиент, вызывает изменения в

оптических свойствах митохондрий, увеличивает скорость обмена

АДФ/АТФ, повышает продукцию АФК, а также инициирует работу

внутриклеточных сигнальных каскадов, ответственных за клеточную

пролиферацию и цитопротекцию (Karu, 2008; Lavi et al., 2003; Passarella,

Perlino, Quagliariello, 1993).

Эффекты световой стимуляции на начальных стадиях связаны с

воздействием света на редокс-цепи, в первую очередь на дыхательные цепи

(Кару, 1986; Karu, 1988). Облучение приводит к ускорению переноса

электронов в дыхательной цепи благодаря изменению компонентов редокс-

цепи при фотовозбуждениях их электронных состояний (Karu, 1989), а

электронное возбуждение изменяет редокс-свойства поглощающих молекул

(Marcus, Sutin, 1995). В ходе данных реакций светопоглощающие эндогенные

порфирины и флавопротеины дыхательной цепи митохондрий способны

выделять синглетный кислород, который, в свою очередь, способен

стимулировать продукцию молекул ДНК и РНК в клетках (Захаров и др.,

1989; Иванов и др., 1989). Данные авторы основную роль в

фотомодификации биологических процессов отдают кислороду, который

благодаря наличию у него полосы поглощения в области 630 нм, активно

поглощает красный свет и переходит в синглетное состояние, индуцирующее

в тканях окислительные процессы. Согласно представлениям некоторых

22

авторов,

молекулы

кислорода, находящегося

в

межлипидном

пространстве мембран клеток, являются основным акцептором лазерного

излучения. Возникающие при этом гидроперекиси липидов в присутствии

восстановленных форм железа инициируют цепную реакцию окисления

полиненасыщенных жирных кислот клеточных мембран и плазмы крови

(Гамалея, 1989; Мостовников и др. 1991).

По мнению Г.А. Залесской и В.С. Улащика (2009) поглощение кровью

лазерного и нелазерного оптического излучения приводит к изменению

функциональных свойств гемоглобина, который рассматривается в качестве

первичного фотоакцептора, поглощающего световое излучение указанных

длин

волн.

Терапевтический

эффект

внутривенной

фототерапии

инициируется модуляцией функциональной активности гемоглобина, и

фототерапия является методом ее коррекции. Данный механизм,

сопровождающий

воздействие

низкоинтенсивного

излучения

на

биологические ткани, получил название фотоиндуцированной диссоциации

оксигемоглобина крови (HbO2) с выделением молекулярного кислорода и

локальным повышением его концентрации в крови. В результате

фотохимической реакции образуется деоксигемоглобин (Hb). Далее

происходит локальный нагрев биотканей, который обусловлен поглощением

излучения и безызлучательной потерей энергии возбуждения молекулами

HbO2 и Hb (Асимов, Асимов, Рубинов, 2008).

Напротив, Р.И. Минц и соавторы (1990) считают, что механизм

действия низкоинтенсивного света на кровь непосредственно не связан с

пигментированными комплексами, сосредоточенными в эритроцитах. Более

того, в цельной крови эффект излучения гелий-неонового лазера подавляется

в сравнении с прозрачной системой – плазмой.

Существует мнение, что основным компонентом, поглощающим свет,

является кровь, концентрация поглощенной энергии для которой в несколько

раз больше, чем для всех остальных тканей (Добкин и др., 1989). Содержание

в крови форменных элементов значительно повышает ее восприимчивость к

23

действию

низкоэнергетического лазерного излучения (Богданович,

1981; Брилль и др., 1994; Попова, 1985; Саперов, Остроносова, Андреева,

1997).

Известно, что низкоинтенсивное лазерное излучение способно

воздействовать не только на эритроциты, но и на другие клетки крови. В

работе А.А. Спасова и соавторов (1998) показано, что свет оказывает прямое

действие

тромбоциты,

что

выражается

в

подавлении

секреции

тромбоцитарных факторов и активности протромбиназы, замедлении

скорости формирования фибринового сгустка. Однако существует обратное

мнение: под действием низкоинтенсивного лазерного излучения происходит

снижение функциональной активности тромбоцитов (Негода, Спасов, Куаме,

1996).

Фотомодификация хотя бы части циркуляторного пула клеток крови, в

частности лейкоцитов, за счёт сдвига в уровне их эффекторных функций

(продукции различных «сигнальных» веществ, например, цитокинов) может

быть основой для наблюдаемых в клинике явлений генерализации лечебных

эффектов низкоинтенсивного лазерного излучения независимо от места

локализации его воздействия (Корочкин, 2001). При воздействии

низкоинтенсивным лазерным излучением на кровь наблюдается явление

интенсификации подготовки лейкоцитов к выполнению кислородозависимого

фагоцитоза. Данное явление получило название прайминга лейкоцитов, которое

на

молекулярном

уровне

заключается

в

сборке

компонентов

мембраносвязанной NADPH-оксидазы, ответственной за продукцию АФК

фагоцитами, и экспрессии «рецепторного» аппарата (Клебанов, Владимиров,

1999; Фейзулла, Соловьева, 1990; Morel Doussiere,Vignais,1991).

С.К. Пирутиным и соавторами (2004) обнаружено, что воздействие

красного света (600-740 нм) на макрофаги приводит к изменению их

внутриклеточного pH и гидролитической активности.

При исследовании влияния низкоинтенсивного лазерного облученияin

vitroна показатели крови крыс было установлено, что красное

низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает структурную адаптацию

24

клеток

крови,

связанную

с изменением

их

агрегационных

свойств и деформируемостью (Дворецкий, Тимошенко, Сергеев, 2008).

В рамках нашего исследования представляют интерес результаты В.В.

Удута и В.А. Прокопьева (2006), которые сообщают, что эффекты

чрезкожного облучения циркулирующей крови светом на длинах волн 600-

700 нм идентичны внутрисосудистому лазерному воздействию по

механизмам формирования, различаясь лишь соотношением долей

составляющих: фотодинамических процессов, процессов фотодиссоциации

оксигемоглобина и фотореактивации антиоксидантных ферментов.

Кроме того, сообщается о значимости действия лазерного излучения не

только на кровь, а на все жидкокристаллические структуры биологических

систем (Захаров, Скоринев, Чудновский, 1989;), такие как цитоплазма,

плазма крови, лимфа, которые при температуре около 37С находятся в

непосредственной близости к точке фазового перехода.

Многие научные лаборатории занимаются воздействием лазерного

излучения на кровь. Однако лишь немногие занимаются измерением

физических параметров лазерного излучения при прохождении через слой

крови (Букатый и др., 2007).

При распространении света в крови важную роль играет рассеяние и

поглощение. Рассеяние света кровью связано с ее структурой, которая

состоит из большого числа случайно распределенных в объеме

рассеивающих центров. Процесс рассеяния приводит к изменениям в

пространственном распределении интенсивности света. В связи с этим,

одной из основных характеристик при изучении светорассеяния является

индикатриса, определяющая интенсивность света как функцию угла

рассеяния. В плотноупакованной системе частиц, какую представляет собой

кровь,

индикатриса

рассеяния

может

несколько

отличаться

от

соответствующего значения для изолированной частицы (Королевич и др.,

1990).

25

Основным

показателем эффективности взаимодействия света

с биообъектом является поглощение света (Udell et al., 1990). Величина

поглощения света зависит от свойств биотканей. Наибольшая эффективность

поглощения излучения в диапазоне длин волн 600-1400 нм наблюдается для

сердца, печени, почек, поджелудочной железы и селезёнки, которые могут

поглощать до 100% излучения; мышцы и кости способны поглотить до 30-

80% излучения; кожа – до 25-40% излучения (Илларионов, 1992, Bahr , 1986).

С поглощением света биообъектов связана резонансная гипотеза

первичных фотобиологических процессов, основанная на поглощении такого

кванта света, энергия которого равна разности энергий нормального уровня

атома и самого нижнего возбуждённого (Козлов и др., 1993).

При воздействии излучения лазеров на биологические субстраты

возникают термические, кинетические, ультразвуковые, электрохимические,

фотохимические и другие эффекты. Большинство применяемых в настоящее

время лазеров работает в красном и инфракрасном диапазонах спектра,

энергия излучения, поглощаясь в атомах и молекулах соединений, усиливает

их колебательные и вращательные движения, т.е. превращается в тепловую

энергию. Преимущества прогрева с помощью когерентных волн

определяются тем, что эти волны проникают вглубь организма и

тепловыделения в значительной мере происходит непосредственно в тканях,

расположенных на некотором расстоянии от поверхности (Девятков, Бецкий,

Голанд, 1998). При этом в области ближнего инфракрасного диапазона

спектра отсутствует резонансное поглощение света тканями. Именно это

явление с их точки зрения обеспечивает глубокое проникновение

инфракрасного излучения в ткани. Поглощаясь тканями, инфракрасное

излучение превращается в тепловую энергию вибрации молекул, что

приводит к локальному повышению температуры на клеточных мембранах и

возникновению градиента температуры в околомембранных областях,

приводящего, в конечном итоге, к раскрытию мембранных каналов,

усилению процессов эндоцитоза, изменению электрохимического ионного

баланса и к повышению потенциальной энергии клетки (Каплан и др.,1989).

26

Следует

подчеркнуть,

что

при воздействии

на

биологические

объекты излучением лазеров на подъем температуры оказывают влияние

следующие факторы: плотность энергии излучения, отражение излучения

лазера, степень гидратации ткани, ее вторичное окружение, электрическая

проводимость (Букатый и др., 2007).

Нерезонансная гипотеза первичных фотобиологических процессов

основана

на

возникновении

градиентов

температуры

за

счет

неоднородностей среды, структурной альтерации жидких сред организма,

конформационных переходах клеточных мембран и прочих эффектах

(Козлов и др., 1993). Градиент температуры, возникающий в

околомембранных областях, вызывает термодиффузионный отток ионов

калия и натрия от мембран, раскрытие мембранных каналов, усиление

эндоцитоза, изменение электрохимического ионного баланса и повышение

потенциальной энергии клетки. Результат зависит от величины градиента

температуры, которая определяется скоростью температурной релаксации в

клетке и параметрами лазерного воздействия, например, частотой посылки

импульсов (Воронина и др., 1992; Москвин, Буйлин, 2000).

В последнее время развивается гипотеза о действии на клетки и

органеллы градиентных сил, возникающих при наличии пространственных

градиентов интенсивности излучения. Данное явление возникает лишь при

освещении объектов когерентным светом, когда появляются определенные

спекл-структуры, образующиеся на поверхности и в глубине объекта. В свою

очередь градиентные силы могут вызывать различные селективные

изменения локальной концентрации и состава среды, повышать парциальную

температуру микрочастиц, приводить к конформационным изменениям

мембран и ферментов (Рубинов, Афанасьев, 2004).

Имеются предположения, что красное низкоинтенсивное лазерное

излучение вызывает изменения проницаемости клеточных мембран для

катионов и воды, сказывающиеся на агрегационной способности и других

реологических свойствах крови (Тимошенко, Дворецкий, 2010). Также

существует мнение, что низкоинтенсивное лазерное излучение способно

27

влиять

на

физико-химические характеристики

воды

(Инюшин,

1970, 1977;Инюшин, Чекурова, 1975). Данное влияние заключается в

изменении скорости переходов ассоциации-диссоциации структурных

элементов

воды,

изменении

электропроводности

воды,

степень

растворимости и ней кислорода (Аксенов, 1985; Козлов, Буйлин, 1993). А.Р.

Евстигнеев, В.Н. Инюшин (1997) наблюдали явление резонансного отклика

воды под действием низкоинтенсивного лазерного излучения. Известно, что

чувствительностью к свету красного диапазона обладают гидрокомплексы

форменных элементов крови, стенок сосудов, белковых молекул и

коллективные модули воды (Малов, Малов, Черный, 1997).

На сегодняшний момент известно о влиянии световой энергии на

состояние клеточных мембран. Во время воздействия на биологические

ткани низкоинтенсивного излучения некоторой достаточной интенсивности

возникает кумулятивный эффект нарастания количества клеток, мембраны

которых испытывают электрический пробой за счет влияния электрических

полей из-за одновременной перезарядки мембран соседних клеток.

Электрическая перезарядка мембран сопровождается открытием ионных

каналов, что приводит к резкому возрастанию проницаемости мембран

(Nicholls et al., 2012). Кроме того, действие низкоинтенсивного лазерного

излучения способно менять форму двойного липидного слоя клеточной

мембраны, что является причиной переориентировок головок липидов

(Владимиров, 1994). Также под действием монохроматического лазерного

излучения изменяется электропотенциал клеточных мембран (Слабкая,

Мешкова, 1992; Степанов, Каплан, Воронина, 1990), в частности мембран

эритроцитов, что сопровождается увеличением их деформируемости и

снижением вязкости цельной крови, а это способствует улучшению

капиллярного кровотока (Амиров, 2008). В качестве одной из причин

изменения структуры и функции мембран при альтерации организма

предлагается интенсификация ПОЛ под действием физических факторов.

Электромагнитное излучение, активирующие липопероксидацию, не

приводит к серьезным повреждениям биомембран благодаря наличию

28

иерархии антиоксидантных систем, блокирующих свободнорадикальные

реакции (Барабой и др., 1992).

В настоящее время все больше авторов связывают биологическую

активность низкоинтенсивного излучения с избирательным поглощением

монохроматического излучения специализированными молекулами –

фоторецепторами. В качестве таких акцепторов выделяют медь-содержащие

ферменты, в частности, каталазу (Аджимолаев и др., 1979; Девятков и др.,

1987; Девятков, Голант, Бецкий, 1991; Зубкова, 1978; Зубкова; Крылов, 1976;

Крылов, 1980; Полонский, 1985), супероксиддисмутазу (Горбатенкова,

Азизова, Владимиров, 1988; Девятков и др., 1987; Елисеенко, 1997; Mosseri,

Gotsman, Insner, 1993; Palrlato et al, 1983); глутатионпероксидазу и

миелопероксидазу (Удут, Прокопьев, 2006); НАДФН-дисмутазу, а также

протопорфирин (Данилова, 1985; Девятков и др., 1987; Hubacek, 1991) и его

производные (Доровских и др., 1999; Приезжев, Тучин, Шубочкин, 1989);

АТФ-азу, ацетилхолинэстеразу, кислую и щелочную фосфотазу (Амиров,

2008); цитохромоксидазный комплекс (Чудновский и др., 1989); пигменты

порфириновой природы (Гамалея и др. 1988; Инюшин, Чекурова, 1975;

Клебанов и др., 2006). Е.А. Горбатенковой и соавторами (1988) сделано

предположение, что механизм фотореактивации инактивированных

супероксиддисмутазы и каталазы при облучении гелий-неоновым лазером

заключается в депротонировании соответствующих гистидиновых остатков и

последующем восстановлении нативной структуры активного центра. Кроме

того, существует мнение, что вид акцептора зависит от вида рабочего

вещества лазера. Так, излучения аргонового лазера адсорбирует в большей

степени гемоглобин, а гелий-кадмиевый лазер – рибофлавин и

цитохромоксидаза (Вахтин и др., 1999).

Поглощая энергию лазерного излучения, акцепторы (антиоксидантные

ферменты) запускают регулируемые ими биохимические процессы, которые

приводят к нормализации уровня процессов ПОЛ и проявлению

29

последующих эффектов на более высоких

уровнях

организации

облучаемых образцов тканей (Другова и др., 2001).

Ряд авторов связывает влияние света на органы и ткани с его

неспецифическое действием на биополимеры путем воздействия на слабые

электронно-конформационные связи биополимеров (Гамалея, 1981). К

биополимерам, способным изменять свое состояние под действием видимого

электромагнитного излучения относятся белки (Березин, Прочуханов,

Ростовцева, 1983) и липиды (Kaufmann, 1980).

Фоточувствительность является общим свойством митохондрий клеток

млекопитающих (Гамалея, Шишко, Яниш, 1983). Вследствие активации

дыхательной цепи митохондрий тромбоцитов под действием красного света

увеличивается продукция активных форм кислорода, под действием которых

происходит активация фермента гуанилатциклазы и ингибирование

агрегации тромбоцитов (Ohyashiki, Konayashi, Matsui, 1991).

На данный момент установлено (Скобелкин, 1997), что эффекты

терапевтического светового воздействия проявляются уже при мощностях

излучения порядка 0,1 мВт/см2. Такие интенсивности, помимо отсутствия

значимого влияния локального нагрева, недостаточны для стимулирования

прямых химических изменений в тканях, связанных с поглощением фотонов.

Эти изменения становятся заметны, когда количество поглощаемых тканью

фотонов

сопоставимо

с количеством

молекул.

Для красного

низкоинтенсивного света интенсивностью 100 мВт/см2, основная часть

которого поглощается на глубине до 1 см, отношение количества фотонов,

поглощенных в течение характерного времени (<10 мкс) фото-

и биохимических реакций, к количеству молекул составляет не более 10-7.

Это позволяет

уверенно

утверждать,

что механизмы

воздействия

низкоинтенсивного света связаны не с непосредственным его влиянием

на ткани,

а с раскрытием

запасенной

в тканях

организма

энергии

(Волькенштейн, 1988).

30

Важный

фактор терапевтического

воздействия

низкоинтенсивного света – периодическая модуляция интенсивности

излучения. Известно, что терапевтическое воздействие модулированного

с определенной частотой низкоинтенсивного света гораздо эффективнее

воздействия

низкоинтенсивного

света постоянной

интенсивности

с аналогичными

другими

характеристиками

и равной

усредненной

по времени мощностью (Рогаткин, Черный).

Как правило, применяемое для терапии импульсное низкоинтенсивного

света имеет частоту модуляции 50-100 Гц (Дурнов, Гусев, Балакирев, 2002).

В одной из работ (Земцев, Лапшин, 1996), при изучении механизмов

очищения поверхности клеточных мембран от токсичных веществ, было

обнаружено, что вызванная лазерным облучением крови деполяризация

активности мембран, сопровождающаяся их «промывкой», происходит

при частоте импульсов низкоинтенсивного света ниже 100 Гц.

Таким образом, под воздействием лазерного излучения происходят

изменения, которые регистрируются на всех уровнях организации живой

материи:

-субклеточном (возникновение возбужденных состояний молекул,

образование свободных радикалов, стереохимическая перестройка молекул,

коагуляция белковых структур и т.п., увеличение скорости синтеза белка,

РНК, ДНК, ускорение созревания коллагена и его предшественников и др.);

-клеточном (изменения заряда электрического поля клетки, изменение

мембранного потенциала клетки и ее проницаемости, повышение

синтетической активности и т.п.);

-тканевом (изменение химизма и рН межклеточной жидкости,

изменение микроциркуляции и т.п., изменение кислородного баланса и

активации окислительно-восстановительных процессов);

-органном (стимуляция или угнетение функции какого-либо органа);

31

-системном

(возникновение ответных адаптационных нервно-

рефлекторных

и

нервно-гуморальных

реакций

с

активацией

симпатоадреналовой и иммунной систем) (Джибладзе, 2003).

В настоящее время существует гипотеза о совместном эффекте

нескольких

фотохимических

реакций:

фотореактивация Cu-Zn

супероксиддисмутазы, которую дополняет фотодинамическое действием

порфиринов (Vladimirov et al., 2004).

Исходя из вышесказанного, можно отметить, что ни одно из

существующих на данном этапе объяснений действия электромагнитного

излучения на организм не раскрывает полностью механизма возникновения

ответа на данное физическое воздействие, а только показывают различные

аспекты реакции организма. Поэтому сводить эффект биостимуляции

низкоинтенсимным излучением видимого диапазона только за счет какого-

либо одного фактора нет оснований.

1.1.2. Влияние низкоинтенсивного красного света на органы и ткани

человека и животных при их альтерации

При

лечении

различных

заболеваний

широко

применяется

низкоинтенсивный когерентный и некогерентный красный свет. Кванты

красного света ускоряют дифференцировку клеток, восстанавливают их

функциональную активность, стимулируют процессы репарации, обладают

иммуномодулирующими, обезболивающими и гипосенсибилизирующими

свойствами (Москвитин, Буйлин, 2000).

В настоящее время известна способность красного светодиодного

излучения положительно влиять на возрастные изменения кожи. Н.М.

Хмельницкой и соавторами (2014) проведен сравнительный анализ влияния

света различной длины волны 650 нм (красный свет), 540 нм (зеленый свет),

470 нм (синий свет) и 400 нм (фиолетовый свет) на морфологию кожи

лабораторных животных. Авторами показано, что все виды излучения

32

вызывали увеличение количества тучных клеток, однако наибольший

эффект наблюдался при воздействии светом красного диапазона. Кроме того,

под действием некогерентного узкополосного излучения длиной волны 650

нм видимой части оптического диапазона электромагнитных волн

происходят изменения эластических свойств кожи лица, характеризующиеся

увеличением способности кожной складки к возврату в исходное состояние

после растяжения, уменьшением растяжимости, повышением упругих

свойств кожи (Кирьянова, Королькова, Кириллова, 2012). Полученные

результаты позволили авторам сделать вывод о возможности использования

данного вида излучения в клинической практике, в частности в программах

коррекции возрастных изменений кожи лица.

Применение фотогемотерапии красным светом при лечении

обострений бронхиальной астмы позволяет добиться положительных

результатов в более короткие сроки, что дает возможность уменьшить

длительность лечения (Островский и др. 2014; Палеев, Карандашов,

Островский, 2011).

Монохромный некогерентный красный свет при лечении хронического

дуоденита оказывает положительное влияние на слизистую оболочку, что

подтверждается уменьшением числа нейтрофилов, лимфоцитов и

плазмоцитов в составе клеточных коопераций собственной пластинки

слизистой оболочки (Евдокимов, Невзорова, Капитонова, 2006). Авторы

предполагают, что одной из причин положительного воздействия красного

света является его влияние на нервную и гуморальную системы слизистой

оболочки двенадцатиперстной кишки. Монохромный красный свет

воздействует непосредственно на процессы тканевого и клеточного

метаболизма и опосредованно, через нервную и гуморальную местные

системы, снижает отек и кровенаполнение в собственной пластинке

слизистой оболочки.

Использование света красного диапазона является эффективным для

активации противоопухолевой защиты. Светодиодное излучение красного

33

спектра проявило себя как фактор, стимулирующий функциональное

состояние лимфоцитов крови больных раком легкого, способствующий

повышению их пролиферативной активности, что проявляется в

статистически достоверном усилении их повреждающего эффекта на

культуру опухолевых клеток К562in vitro, одним из механизмов реализации

которого служит апоптоз (Шейко, Златник, Закора, 2009). Активация

кислороднезависимых систем бактерицидности нейтрофилов происходит в

основном при облучении светодиодным излучением красного диапазона,

использование светодиодного излучения синего света с этой целью

неэффективно (Шейко, Белан, 2009).

На данном этапе неоспоримым является влияние низкоинтенсивного

красного света на сократительную активность изолированного сердца после

ишемии (Монич и др., 1999). Одним из ключевых механизмов данных

эффектов является световая регуляция процессов перекисного окисления

липидов (Монич и др., 2010). Подобные эффекты наблюдаются при

облучении изолированного сердца светом гелий-неонового лазера и

широкополосным красным светом (Монич, Другова, Житникова, 2001).

Результатом нормализации процессов свободнорадикального окисления

является восстановление параметров электрической активности сердца.

Некоторые авторы полагают, что излучение красного диапазона

положительно влияет на эмбриональное развитие (Nakayama et al., 1994).

А.С. Черновым и соавторами (2013) показано, что облучение

преобразованным светом с дополнительной люминесцентной компонентой

длиной волны 626 нм значительно снижает процент аномально развитых и

нежизнеспособных эмбрионов мышей. В то же время на состояние

эмбрионов культуре отрицательно сказывается освещение видимым светом

(стандартное лабораторное освещение и освещение стереомикроскопов)

(Hegele-Hartung, Schumacher, Fisher, 1991; Oh, Gong, Lee, 2007; Schumacher,

Fischer, 1988). Наиболее повреждающее действие видимый свет оказывает в

синей части спектра (445-450 нм), приводя к синтезу белков теплового шока,

34

а также к увеличению количества апоптотических клеток в эмбрионах

(Umaoka et al., 1992).

В настоящее время обсуждается возможность использования света

красного диапазона в стоматологии. Г.Б.Кобзева (2013) рекомендует

включение облучения модулированным диодным светом в красной области

спектра в комплексную терапию хронического пародонтита, так как

семидневный курс облучения полости рта дает клиническую ремиссию в

100% случаев. Также терапия красным когерентным светом может

использоваться в комплексном лечении плоского лишая полости рта. Данный

вид терапии оказывает противовоспалительное и обезболивающее действие,

приводит к ускорению эпителизации слизистой оболочки полости рта на 50%

(Калинина и др., 2011; Орехова, Лабода, Обоева, 2015). Также

анальгетическое действие светодиодного излучения красного спектра

отмечено при синдроме жжения полости рта (Борисова, 2012). В

стоматологической практике применение некогерентного света красного

диапазона также обосновано при лечении деструктивных форм периодонтита

(Миронова, Физюкова, Соломатина, 2014) и в профилактике рецидивного

кариеса (Аратюнян и др., 2011; Кунин, Беленова, Кудрявцев, 1999).

В литературе присутствуют сведения о положительном влиянии

светодиодного излучения красного диапазона на гематологические,

цитологические и гистологические показатели при лечении инфицированных

кожно-мышечных ран в клинике (Ермолаев и др., 2015) и в эксперименте

(Моторина и др., 2013; Сыч, Столбовская, Калачева, 2000). Сходные

сведения существуют и для излучения гелий-неонового лазера (Мачнева и

др. 2010).

В литературе имеются указания, что сочетанное воздействие красным,

инфракрасным светом и магнитом позволяет улучшить состояние

репродуктивной системы женщин после операций на маточных трубах при

бесплодии (Диамант, Лаптев, Сидоренко, 2003).

Однако существуют исследования, свидетельствующие о негативном

влиянии света красного диапазона на некоторые ткани. В работе Д.И.

35

Шабанова

и

соавторов (2014)

установлено, что темновая инкубация

и фотомодификация клеток селезенки мышей с красителем в течение 30

минут способствуют снижению уровня их жизнеспособности через 22 часа

наблюдения,

усиливающемуся

в

образцах,

подвергнутых

фотодинамическому воздействию красным светом.

Красный свет (длина волны 670 нм), как и синий, способен повреждать

бактериальные клеткиEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae иPseudomonas

aeruginosa (Гречуха, 2015). Принцип действия красного света при

фотодинамической терапии заключается в избирательной окислительной

деструкции структур микроорганизмов при сочетанном воздействии

химического соединения – фотосенсибилизатора и оптического излучения с

длинами

волн,

соответствующими

спектру

поглощения

фотосенсибилизатора. Принцип метода состоит в том, что, при поглощении

квантов света молекулы фотосенсибилизатора, связанные с микробной

клеткой, переходят в фотовозбужденное состояние и передают энергию

возбуждения на молекулярный кислород с образованием цитотоксичного

синглетного кислорода (Корабоев и др., 2001; Пальчун и др., 2007).

Бактерицидное действие света красного диапазона подтверждается

исследованиями, проведенными в клинике. Так, под влиянием проводимого

лечения с помощью красного света отмечались быстрый регресс основных

симптомов тонзиллита, нормализация показателей системного иммунитета и

цитокинового статуса (Песчаный и др., 2009).

Р.Н. Храмов и соавторы (2010) при исследовании действия

люминесцентного излучения оранжево-красного цвета установили, что свет

данного спектра приводит к уменьшению уровня повреждающего действия

факторов гипертонии в эксперименте.

Авторы (Новоселова и др., 2007), изучающие влияние облучения

тимуса гелий-неоновым лазером (длина волны 632,8 нм) на активность

клеток иммунной системы в условиях острого токсического стресса,

связывают облучение лазерным светом и заметное снижение токсического

эффекта липополисахарида.

36

Показано,

что низкоинтенсивное

гелий-неоновое

лазерное

излучение

обладает

лимфокорригирующим

и

лимфостимулирующим действием в условиях развития патологического

процесса (Анцырева и др., 2007; Бурдули, Пилиева, Джабишвили, 2008;

Букатый и др., 2007; Котье, Тюрк, Собен, 1973; Леонтьева, 2005), а

чрезкожное

низкоэнергетическое

лазерное

облучение

способствует

восстановлению морфофункциональных изменений в лимфатических узлах в

условиях циркуляторной гипоксии (Бородин и др., 2008; Костина Л.Ю.,

Волков А.В., Надеев А.П, 2011). М.О. Хреновым и соавторами (2007)

установлено, что красный лазерный свет подавляет продукцию лимфоцитов

селезенки, что свидетельствует о отсутствии стрессового характера ответа

лимфоцитов на данный тип воздействия.

В рамках данного исследования интерес представляют данные

литературы, связанные с коррекцией радиационно-индуцированных

повреждений тканей и органов с помощью светодиодного излучения

красного диапазона.

Анализ результатов использования широкополосного излучения

данного диапазона в исследовательской и клинической практике доказывает

эффективность его применения для коррекции нарушений, вызванных

различными патологическими факторами. Однако в литературе имеются

лишь отрывочные сведения о влиянии красного светодиодного излучения на

ткани, поврежденные ионизирующей радиацией.

Так, Л.И. Симоновой и соавторами (2010) показано, что использование

фототерапии с оптическим излучением красного света (630-660 нм)

позволяет существенно снизить степень тяжести радиоиндуцированных

кожных реакций у больных раком грудной железы во время проведения

послеоперационной лучевой терапии гамма-излучением, что позволяет

сделать вывод о радиопротекторных свойствах низкоинтенсивного

широкополосного излучения данной длины волны.

37

Радиопротекторное

действие красного

светодиодного

света

выявлено данным коллективом авторов и в эксперименте (2009, 2011). В

изучении действия терапии монохроматическим светом синего и красного

диапазонов на заживление радиационного поражения кожи у крыс после

локального облучения рентгеновскими лучами обнаружено, что терапия

красным светом способствовала предотвращению появления влажного

дерматита, отодвигала появление лучевых язв на более поздние сроки,

уменьшала их количество и ускоряла заживление.

Не смотря на присутствие сведений о положительном действии

красного широкополосного света на очаги радиационного поражения на

поверхностный слой кожи, результаты о влиянии низкоинтенсивного

излучения красного диапазона на радиационно-индуцированные поражения

внутренних органов и мягких тканей отсутствуют.

Также среди литературы, посвященной теме данного раздела,

отсутствуют сведения о влиянии широкополосного красного света на ткани,

поврежденные излучением высокоинтенсивного лазера.

Наиболее близкой к тематике нашего исследования оказалась работа

Ю.Б. Кудряшова и соавторов (1996) по изучению фотовосстановления УФ-

индуцированных повреждений тканей млекопитающих с помощью видимого

света с длиной волны 680 нм. Облучение монохроматическим красным

светом сразу после воздействия УФ-излучения (254 нм, 5-20 Дж/кв.м)

приводило к восстановлению повреждений и повышению выживаемости

клеток китайского хомячка. Для максимального эффекта красного света

достаточно дозы 60 Дж/кв.м, что меньше доз, необходимых для

восстановления повреждений с помощью фотореактивации с максимумом в

синей области.

Кроме того, Р.Н. Храмовым и соавторами (2007) показано, что

оранжево-красный

свет

снижает

ингибирование

ультрафиолетом

пролиферации фибробластов крыс. Оранжево-красная компонента света

влияет на жизнеспособность клеток млекопитающих (фибробласты,

38

эпителиальные и клетки роговицы глаза кролика) в условияхin vitro.

При этом наличие даже небольшой по интенсивности дополнительной

люминесцентной компоненты (длина волны 626 нм) в спектре солнечного

света приводит к стимуляции внутриклеточных процессов и повышению

регенеративных возможностей организма, что выражается в увеличении

жизнеспособности клеток (Фахранурова и др., 2014).

Фотоиндуцибельная

защитная

система

от

ультрафиолетового

излучения известна также для клеток микроорганизмов. Так, красный свет

длиной волны 680 нм способен устранять ультрафиолет-индуцированные

повреждения ДНК у дрожжейS. Cerevisiae (Пиняскина, 2008; Пиняскина,

2011; Фрайкин и др., 2013).

Также обращает на себя внимание отсутствие данных о влиянии

светового воздействия на организм человека и животных, переживших

асфиксию.

Информация о значении терапии низкоинтенсивным лазерным

излучением красного диапазона для улучшения показателей устойчивости к

гипоксии присутствует в работах двух коллективов авторов.

Ю.Н. Черных и соавторы (2013) показали, что применение

низкоинтенсивного лазерного излучения оказывает антигипоксическое

действие при лечении больных с хронической обструктивной болезнью

легких. Кроме того, применение низкоинтенсивного лазерного излучения

оказывает бронхолитическое действие и способствует более ранней

нормализации основных показателей функции внешнего дыхания по

сравнению со стандартизованными методами лечения.

Данные, полученные Т.М. Брук и соавторами (2010) свидетельствуют о

положительном эффекте влияния низкоинтенсивного лазерного излучения

красного диапазона на функцию дыхания спортсменов. В частности,

авторами установлено, что однократное воздействие низкоинтенсивного

лазерного излучения на проекции сосудов биологически активных областей

вызывает антигипоксический эффект, который заключается в повышении

39

способности

организма

всех испытуемых

временно

компенсировать изменения газового гомеостаза. Таким образом, однократное

воздействие низкоинтенсивного лазерного излучения при этом стимулирует

экстренные приспособительные реакции.

Использование

низких

энергий

лазерного

излучения

с

физиотерапевтической целью показало хорошую переносимость больными,

отсутствие патологических сдвигов со стороны кроветворной, сердечно-

сосудистой и адаптационно-приспособительной систем (Нечипуренко и др.,

2008).

Не смотря на положительные аспекты применения фототерапии,

существует возможность передозировки лазерным излучением (Байбеков и

др., 1991; Байбеков, Байбекова, 1999), когда в клетках и тканях могут

возникать обратимые и необратимые альтерации (Мешкова и др., 1992;

Чекуров, 1976). К лазерным поражениям клетки относится вакуолизация

цитоплазмы (Кошелев, Чалык, Сафронов, 1997), вызванная инактивацией а-

каналов, в связи с чем происходит нарушение проницаемости клеточной

мембраны (Зубкова и др., 1994). При этом различные типы клеток реагируют

по-разному на передозировку лазерным излучением. Кроме того, степень

выраженности повреждающего действия зависит от длины волны лазерного

излучения и его мощности. На уровне ткани передозировка лазерного

излучения приводит к нарушению капиллярного кровотока и изменению

клеток крови (снижению функциональных возможностей нейтрофилов,

повышению количества эозинофилов и тучных клеток в циркулирующей

крови, а также дегрануляции тучных клеток). Местные отрицательные

эффекты отражаются на течении типовых реакций организма, в том числе

сосудистых и воспалительных (Казимирко, Клодченко, 1993). На

передозировку лазерным излучением может указывать так называемый

симптом «щелчка». Суть данного феномена состоит в моментальном

преобразовании в фокусе поглощения лазерной энергии воды в пар, что,

40

кроме увеличения объема вещества, ведет к образованию ударной и

звуковой волн (Качанов, 1998).

Высокоинтенсивное

лазерное

изучение

вызывает

различные

фототермические реакции в биологических тканях: денатурация белка (от

40oС), коагуляция (от 65oС), испарение (от 100oС) и карбонизация при более

значительной температуре (от 500oС) (Bedi et al., 2007).

Среди литературы, посвященной влиянию высокоинтенсивного

лазерного излучения на ткани и органы, отсутствуют сообщения о

исследовании

возможности

коррекции

негативных

последствий

использования лазеров высокой мощности в клинике с помощью

широкополосного красного света.

В то же время существуют сведения о активации процессов

свободнорадикального окисления под действием высокоинтенсивного лазера.

В частности, лазерное излучение высокой мощности усиливает процессы

липопероксидации мембран эритроцитов (Полуднякова и др., 2012). Также

авторы отмечают возрастание активности глутотион-S-трансферазы

эритроцитов, которая наблюдается лишь при высоких интенсивностях

инфракрасного лазерного излучения. Изменения активности каталазы не

наблюдалось.

В литературе присутствуют сведения, что инфракрасный свет (1264±4

нм) может напрямую возбуждать молекулы кислорода в биологических

системах и тем самым вызывать гибель клеток за счет «свето-кислородного

эффекта» (Захаров, Иванов, 1999; Корси, Соколов, 2009; Schweitzer, Schmidt,

2003). Тем самым происходит фотогенерация синглетного кислорода из

растворенного в клетках молекулярного кислорода. Вступая в реакцию с

биомолекулами, он может участвовать в цепных свободнорадикальных

реакциях, вызывать окисление белковых молекул, инициировать процессы

перекисного окисления липидов (Генинг и др., 2014).

При этом многие авторы отмечают существование антиокидинтного

действия низкоинтенсивного лазерного излучения (Белов, Харламова, 2007;

41

Васильева, 1996; Волотовская, Улащик, Филиппович, 2003; Гацура,

Гладких, Титов, 2004).

Учитывая широкое применение высокоинтенсивных лазеров в

клинической практике, поиск возможного использования светодиодного

красного света для нормализации процессов свободнорадикального

окисления, вышедших из-под контроля после воздействия когерентным

излучением высокой мощности, представляется актуальным.

Таким образом, к наиболее важным для практики лечебными

эффектам терапии низкоинтенсивным электромагнитным излучением

видимого

диапазона

можно

отнести:

сосудорасширяющий,

противовоспалительный,

иммунокоррегирующий,

детоксикационный,

метаболический, обезболивающий, трофикорегенераторный (Донцов, 2012).

1.1.3. Эффекты воздействия света синего, зеленого и желто-

оранжевого диапазонов на органы и ткани человека и животных при их

альтерации

Помимо красного света, применение которого широко известно в

медицине благодаря его способности наиболее глубоко проникать в ткани

организма и цельную кровь, в исследовательской и практической

деятельности нашел применение свет и других диапазонов.

Из работ последних лет стало очевидным, что синий свет обладает

бактерицидным действием. Согласно данным исследованиям,свет синего

диапазона способен инактивировать бактерииЕ. coli, S. aureus и P. аeruginosa

(Аметистов и др., 2005; Кешишян и др., 2014); обладает угнетающим

действием в отношенииDermabacter hominis (Тучина и др., 2012),

Porphyromonas gingivalis (Kotoku et al., 2009),Staphylococcus aureus

(Enwemeka et al., 2008),Propionibacterium acnes (Ashkenazi et al., 2003),

Staphylococcusepidermidis (Tuchina, Tuchin, 2009),Pseudomonas aeruginosa (Sailer et al., 1997). В работе З.П. Худоноговой и соавторов (2011)

42

рекомендуется

использование источника

синего

монохромного

света для лечения стафилококковой инфекции ротоглотки. Другими

коллективами авторов прдлагается использование света данного диапазона в

тепапии хронического пародонтита (Ешиев, Анзор, 2014;Курочкина, Солове,

Юрага, 2009). Е.С. Кешишян, В.С. Зродниковым и В.А. Подсосонным (2006)

предложена методика лечения легких и средне-тяжелых форм острых

респираторных вирусных инфекций облучением слизистой оболочки полости

рта и глотки монохроматическим синим светом. Бактерицидные свойства

синего света связаны с образованием под его действием внутри клеток малой

концентрации синглетного кислорода, который запускает каскад свободно-

радикальных реакций; последние стимулируют фагоцитоз и бактерицидные

свойства фагоцитов. Кроме того, под действием квантов синего света

высвобождаются связанные гемоглобином молекулы окиси азота, которые

приводят к расслаблению эпителия микрососудов. Кровь начинает более

интенсивно омывать слизистые оболочки, что также приводит к усилению

бактерицидного и вирицидного эффектов.

Синий свет, как и зеленый способен разрушать молекулы билирубина и

применяться в лечении гепатитов (Roll, Christensen, 2005; Roll, Christensen,

Gederaas, 2005; Roll, 2005). Процедура облучения крови синим светом дает

позитивный эффект при лечении хронического алкоголизма и способствует

исчезновению соматовегетативных и психопатологических проявлений

абстиненции. Кроме того, воздействие синим светом нормализует отдельные

биохимические показатели крови, такие как билирубин, бета-липопротеиды,

холестерин (Карандашов, Дронова, Дронов, 2006). И.О. Маринкин и

соавторы (2012) при исследовании морфологии печени при наличии очага

хронического

воспаления

выявили

улучшение

микроциркуляции;

уменьшение дистрофических изменений гепатоцитов и воспалительной

реакции; снижение количества пролиферирующих фибробластов в

портальных трактах, уменьшение концентрации сульфатированных

43

гликозаминогликанов

в

области триад и стенках центральных вен под

действием синего света.

В настоящее время известно ранозаживляющее действие синего света

(Тимен и др., 1988; Толстых и др., 2013). Применение различных видов

оптического излучения, в том числе синего света, является эффективным

звеном в лечении длительно незаживающих ран и язв нижних конечностей

(Карандашов и др., 2010).

Свет синего диапазона может быть использован для лечения

повреждений не только мягких тканей, но и костей. А.М. Ешиев и Д.А.

Ешиев (2013) допускают возможность применения синего света для лечения

различных костных дефектов альвеолярного отростка верхней и нижней

челюстей. Авторы считают данный метод экономически более выгодным по

сравнению со многими используемыми методами и препаратами.

При лечении ишемической болезни сердца включение в терапию

облучения собственной крови синим светом вызывало достоверное снижение

уровня общего холестерина, липопротеидов низкой плотности и повышение

уровня липопротеидов высокой плотности (Диасамидзе, 2004).

На данный момент известно анальгетическое действие синего света.

А.К. Василькиным и соавторами (2009, 2011) установлено, что синий свет

длиной волны 470 нм позволяет купировать болевой синдром у 93,3%

больных с люмбоишиалгией, увеличить сроки ремиссии и уменьшить

количество обострений, что, в конечном итоге, приводит к улучшению

качества жизни пациентов. Также включение в терапию невропатии лицевого

нерва светодиодного излучения той же длины волны оказывает выраженное

болеутоляющее

действие

(Гузалов

и

др., 2012); использование

поляризованного некогерентного света синего диапазона имеет значимый

обезболивающий эффект при шейных дорсопатиях (Люткевич, 2015).

Согласно данным литературы, синий свет может быть использован при

лечении миокардитов (Островский, 2000; Палеев и др., 2005), стенокардии

44

(Карандашов

и

др., 2003),

туберкулеза легких (Левашов и др.,

2007; Kiriyanova et al., 2008), алкогольного абстинентного синдрома (Дронов,

Дронова, 2010; Дронова, Карандашов, Дронов, 2005), депрессивных

расстройств (Еликова и др., 2005), сезонных аффективных расстройств

(Шешунова и др., 2007), бронхиальной астмы (Островский, Карандашов,

Шатохина, 2014), флегмоны (Ешиев А.М., Абдуллаева, 2013).

На данный момент существуют многочисленные данные о

использовании

видимого

света

синего

диапазона

при

лечении

дерматологических заболеваний, таких как акне (Утц, Галкина,

Райгородский, 2013; Ammad et al., 2002; Gold, Rao, Goldman, 2005; Kawada et

al., 2002; Kjeldstad, 1987; Meffert et al, 1990;Morton et al, 2005;Papageorgiou, Katsambas, Chu, 2000; Shalita et al, 2001; Tzung, Wu, Huang, 2004), а также

фурункулов лица (Батраков и др., 2011).

Некоторые авторы отмечают возможность использования лазерного

излучения синего спектра в онкологии. Показано, что низкоинтенсивное

лазерное излучение в диапазоне синего света способно влиять на прогрессию

лимфосаркомы Плисса, стимулируя дистрофические и некротические

изменения в опухолевых клетках (Кулакова, Щербатюк, Чернов, 2012) и

тормозить рост опухоли асцитной карциномы Эрлиха в эксперименте

(Манина, Улащик, Куклова, 2010). Полученные результаты могут быть

основаны на активно разрабатываемом в последнее время фотодинамическом

механизме

первичного

действия

низкоинтенсивного

излучения.

Фотосенсибилизаторами могут быть не только внесенные извне соединения,

которые селективно накапливаются в опухолевой или бактериальной клетке,

но и эндогенные вещества, присутствующие в живых клетках. Это, прежде

всего, порфирины и флавины. Порфирины поглащают в сине-фиолетовой

(415 нм) и красной (660 нм) областях спектра; максимум поглощения

флавинов находится на длине волны 450 нм. Порфирины, поглощая

излучение, индуцируют свободнорадикальные реакции, приводя к

увеличению содержания в клетке свободных радикалов и реактивного

45

синглетного

кислорода,

которые подавляют

жизнедеятельность

клеток, могут вызывать их апоптоз и некроз (Манина, Улащик, Куклова,

2010).

В.И. Павловым, В.И. Карандашовым и Е.В. Линде (2015) установлено

достоверно выраженное возрастание максимального потребления кислорода

(максимальной

«аэробной

мощности»)

и

изменение

показателей,

свидетельствующих о возрастании процессов «экономизации» сердечной

деятельности, при исследовании влияния синего света на физическую

работоспособность и сократительную функцию миокарда спортсменов.

В результате исследований Л.И. Симоновой и соавторов обнаружено

радиопротекторное действие синего света. В исследовании действия терапии

монохроматическим

светом

синего

и

красного

диапазонов

на

морфофункциональную картину заживления радиационного поражения кожи

у крыс после локального облучения (2011) обнаружено, что синий свет

значительно раньше стимулировал локальный иммунный ответ на

воспаление. Процессы организации некроза глубоких слоев кожи шли со

значительным опережением в «синей» группе, в то же время при лечении

красным светом, рядом с организацией, в этих слоях еще долго сохранялись

мелкие некрозы и незрелая грануляционная ткань. Терапевтический эффект

синего света доминировал над красным в связи с более ранней стимуляцией

клеточных и иммунных реакций в дерме.

В результате изучения влияния разных спектральных участков

монохроматического оптического излучения (красного, синего и зеленого

света) на кожу после локального рентгеновского облучения выявлены

следующие отличия. Эффект красного света заключался в том, что его

действие способствовало предотвращению появления влажного дерматита,

отодвигало появление лучевых язв на более поздние сроки, уменьшало их

количество и ускоряло заживление. Профилактическое действие синего света

сопровождалось развитием влажного дерматита у 30% крыс, о полностью

предотвращало появление лучевых язв и значительно сокращало сроки

46

заживления лучевых дерматитов. Профилактическое действие зеленого

света было наименее выражено (Симонова, Белогурова, Гертман, 2009).

В то же время, при изучении влияния светодиодного облучения синего

и красного диапазонов на агрегационную активность тромбоцитов

установлено, что облучение крови красным светом (630 нм) приводит к более

выраженной фотоактивации тромбоцитов по сравнению с синим светом (450

нм) (Петрищев, Зубов, Дементьева, 2011).

В ходе многолетних исследований В.И. Карандашовым и соавторами

выявлены следующие быстрые и медленные «ответы организма на синий

свет»: снижение вязкости крови, модулирующий эффект при нарушении

агрегации тромбоцитов, увеличение активности факторов VIII и IX

свертывающей системы крови, выраженное положительное влияние на

магистральный кровоток и систему микроциркуляции, снижение уровня

атерогенных липидов крови, положительное влияние на функцию внешнего

дыхания, моделирующий эффект со стороны иммунной системы

(Карандашов, 2011; Карандашов, 2013).

Однако в литературе присутствуют сведения о негативном влиянии

света синего диапазона на развитие зародыша. При работе с зародышами

мышейin vitro показано, что, в отличие от красного света, положительно

влияющего на эмбриональное развитие, отрицательное действие синего

света проявляется в изменении морфологии первичной колонии и нарушении

процессов дифференцировки и миграции клеток трофобласта и

внезародышевой энтодермы (Сахарова и др., 2014).

Считается, что механизм действия синего света в значительной степени

связан с возможностью стимуляции энергитического обеспечения клетки за

счет усиления синтеза энергии в митохондриях (Векшин, 1988). Это

обусловлено тем, что важнейшие флавопротеины, участвующие в процессах

аэробного фосфорилирования, поглащают свет в синей области спектра.

Существует мнение, что фотоакцепторами синего света являются

криптохромы, выявленные как у млекопитающих, так и у растений (Emery et

47

al., 1998; Kobayashi et al., 1998). Также, возможно, к хромофорам

синего света относится рибофлавин (Bouillaguet et al, 2008).

В настоящее время во всем мире интенсивно развивается относительно

новая медицинская технология – фотодинамическая терапия. Суть метода

состоит в том, что многие биологические объекты накапливают

биологические красители – фотосенсибилизаторы, в результате чего они

становятся чувствительными к воздействию энергии света, а также

низкоинтенсивного лазерного излучения (Ешиев, Ешиев, 2013).

Механизм фотодинамической терапии сложен и до конца не изучен.

Выделяют две фазы воздействия фотодинамической терапии на опухолевую

ткань: фотодинамический эффект, иногда называемый фотодинамической

реакцией, и процессы, происходящие в опухоли после ее завершения, то есть

процесс разрушения непосредственно ткани опухоли. Известно, что

основную роль в фотодинамической терапии играет так называемый

синглетный кислород, который образуется в молекулах липидов и белков

мембран клеток и внутриклеточных органелл при воздействии на них кванта

света (Толстых и др., 2001). Под действием синглетного кислорода

роисходит разрыв цепочки молекулы и ее разрушение с образованием

свободных радикалов и повреждением клеточных мембран, причем этот

процесс происходит в течение нескольких минут после начала облучения

лазером (Moan, McGhie, Jacobsen, 1983). Молекула фотосенсибилизатора при

поглощении кванта света также переходит в синглетное состояние и передает

энергию молекуле кислорода, переводя ее в синглетное состояние

(Красновский, 2004). Возбужденные

молекулы

кислорода

и

фотосенсибилизатора возвращаются в исходное состояние и способны

вступать

в

химические

реакции.

После

нескольких

циклов

фотосенсибилизатор «выгорает», т. е. теряет способность участвовать в фото-

динамической реакции. Этот эффект получил название фотобличинга

(McCaughan, 1999).

48

Терапия

светом

зеленого диапазона распространена гораздо

меньше и эффективна при лечении некоторых заболеваний. Так, лечение

зеленым светом способствует выраженному снижению артериального

давления и показано больным артериальной гипертонией (Алиева, Осипова,

Кулишова, 2006; Васькова, Овчинникова, Янкина, 2008; Князева и др., 2006;

Отто, 2006). Также С.Г. Абрамовичем и соавторами (2008) доказано

положительное влияние зеленого света на клинические проявления

заболевания и морфофункциональное состояние сердечно-сосудистой

системы у больных гипертонической болезнью пожилого возраста.

Облучение зеленым светом способствует выраженной ремиелинизации

нервного волокна и оказывает положительное влияние на функциональное

состояние нерва в экспериментальной модели компресионно-ишемической

невропатии (Гузалов, Кирьянова, 2011).

А.В. Никитиным и соавторами (2008) показано, что в терапию

бронхиальной астмы целесообразно включать хромотерапию именно

зеленым светом, так как этот метод хромотерапии обладает выраженным

противовоспалительным и бронхолитическим действием, способствует

нормализации основных клинико-лабораторных признаков обострения и

удлинению сроков ремиссии в сравнении с другими видами света.

Наименьшее применение в медицине нашел свет желто-оранжевого

диапазона.

Г. Бижак и М.В. Кобав (2012) показали, что монохроматические

источники света с излучением в жёлтой части видимого спектра (янтарные

светодиоды) оказывают меньшее влияние на секрецию мелатонина, по

сравнению с источниками, излучающими в ругих частях спектра.

При воздействии голубым и желто-оранжевым поляризованным светом

отмечается

подавление

функциональной

активности

облучаемых

биологических объектов (Карандашов, Петухов, Зродников, 2001).

Однако желтый свет оказался более эффективным по сравнению с

другими при лечении астении и соматовегетативных дисфункций в

49

комплексной терапии больных с астенодепрессивным синдромом при

невротических расстройствах (Кирьянова и др., 2012).

Существует мнение, что использование совместно света синего и

красного спектров производит лучший терапевтический эффект (Shibata et al,

2005). Так, А.Ч. Буцель и И.В. Долиной (2010) разработан новый безопасный

способ лечения вазомоторного ринита у беременных женщин, основанный на

действии поляризованного синего и красного света. По мнению авторов,

терапевтические эффекты линейного поляризованного синего света

обусловлены его анальгетическим действием, а красного – способностью

ускорять кровоток. Кроме того, добавление в стандартную терапию

последствий огнестрельных и минно-взрывных поражений лица, головы и

шеи света красного и синего диапазонов показало высокую эффективность.

Данный метод предотвращает развитие тяжелых гнойно-септических

осложнений, способствует уменьшению объемов лекарственной терапии,

значительно сокращает сроки лечения больных и создает условия для более

ранней их реабилитации и дальнейшего пластического и косметического

восстановления (Лапченко, Кучеров, Ордер, 2013).

В последнее время применяется метод импульсной цветотерапии,

заключающийся в воздействии светом различных цветов, подаваемым с

различной частотой и длительностью импульса. Метод обладает всеми

преимуществами физиотерапевтических методов лечения: не обладает

побочными эффектами, оказывает положительный эффект на весь организм в

целом, мягко влияет на отдельные органы и системы (Точилина О.В.,

Андреева, 2012).

Существуют сведения о возможности совместного использования света

красного, голубого и зеленого диапазонов. Голубой (458 нм) и зеленый

светодиодный свет (546 нм) применялся в дополнение к ранее

использовавшемуся красному лазеру с длиной волны 635 нм при лечении

заболеваний печени. Вероятно, что даже если зеленый и голубой свет не

проникали в печень, то происходило явное положительное воздействие на

50

иммунную

систему,

что

дает хороший

эффект

в

лечении

первичного склерозирующего холангита (Ану Макела, 2014).

1.2. Свободнорадикальное окисление

1.2.1. Механизм перекисного окисления липидов

Перекисное окисление липидов является свободнорадикальным

процессом, протекающим с полиненасыщенными жирными кислотами

(ПНЖК), входящими преимущественно в состав липидного бислоя мембран

и

липопротеидных

комплексов.

Свободнорадикальное

(перекисное)

окисление непрерывно протекает в норме во всех тканях живых организмов и

свободнорадикальные процессы при их низкой интенсивности являются

одним из типов нормальных метаболических процессов (Бурлакова, 1981).

Непременным условием осуществления ПОЛ является образование

активных форм кислорода (АФК), являющихся более сильными

окислителями, чем молекулярный кислород (Зенков, Меньшикова, Шереин,

1993). Подавляющее большинство реакций в клетках аэробных организмов

являются кислородзависимыми. В основном, не возбужденном, состоянии в

молекуле кислорода неспаренные электроны имеют параллельные спины и

локализованы на π-разрыхляющих молекулярных орбиталях, т.е. находятся в

триплетом состоянии. Такая электронная конфигурация является причиной

низкой реакционной способности молекулярного кислорода по отношению к

стабильным органическим соединениям со спаренными электронами на

орбиталях (Владимиров, 1987).

Основным субстратом для ПОЛ служат полиненасыщенные

жирнокислотные остатки фосфолипидов мембран и липопротеинов плазмы.

В мембранах клеток преобладает арахидоновая кислота , именно она и является

основным субстратом ПОЛ. Процесс ПОЛ начинается со стадии инициации

(зарождения цепи). При этом происходит взаимодействие активных форм

кислорода с ненасыщенными жирными кислотами в молекуле липида – RH

согласно следующим реакциям:

51

О-

-

2 + RH → R• + HO2

OH• + RH → R• + H2O

RH + HO •2 → R• + H2O2

RH + HO •

2 → RO2 + H2O

Главный продукт этой стадии, образующийся в результате

одноэлектронного переноса — липидный алкильный радикал (R•). Этот

радикал необходим для дальнейшей стадии – продолжения и разветвления цепи.

Радикал R• вступает во взаимодействие с кислородом:

R• + O2 → ROO•

ROО• — перекисный радикал, который, взаимодействуя с новой

молекулой субстрата, генерирует гидроперекись и новый радикал:

ROO• + R

1H → ROOH + R1

Таким образом идет накопление перекисей и сохранение неизменного

количества

образовавшихся

в

результате

инициации

радикалов

(Конторщикова, 2000).

Далее следует разветвление цепи, в результате которого количество

свободных радикалов может нарастать лавинообразно за счет следующих

реакций:

ROOH + Fe2+ → RO• + OH- +Fe3+

ROOH + RH → RO• + R• + H2O

RO• + RH → ROH + R•

R• + O

2 → RO2

Однако неограниченного накопления радикалов не происходит в

результате обрыва цепи. На этой стадии происходит взаимодействие

радикалов между собой и с естественными ингибиторами ПОЛ (InH)

R• + R• → МП

RO •2 + R• → МП

RO •

2 + RO2 → МП + hυ

52

где

МП – молекулярные продукты; hυ – свечение

(хемилюминесценция) квантов света, образующихся при рекомбинации

перекисных радикалов (Чевари и др.,1992).

Регистрация хемилюминесценции позволяет оценить количество

перекисных радикалов, т.е. проанализировать способность биологического

объекта к перекисному окислению липидов.

RO •2(R•) + InH → ROOH(RH) + In•

RO •2(R•) + Fe2+ → Fe3++ RH

Радикал-ингибитор (In) имеет невысокую активность и может также

вступать в реакции обрыва:

In• + ROO• →RO2In

In• + In• = In2

Эти реакции дополнительно связывают некоторое количество

перекисных радикалов RO2 и обеспечивают нейтрализацию радикалов

ингибитора (Меньшикова, Зенков, 1993). Указанные реакции очень важны,

поскольку радикалы ингибиторов сами могут реагировать с ПНЖК и

образовывать радикал согласно следующей реакции:

In• + RН → InН + R•

Среди образующихся в ходе ПОЛ продуктов выделяют:

1.

Первичные (гидроперекиси, диеновые конъюгаты, эндоперекиси),

образующиеся на стадии продолжения цепи. Одним из основных

критериев интенсивности процессов ПОЛ является образование в

ПНЖК сопряженных (конъюгированных) двойных связей: диенов

— С = С —С = С— с максимумом поглощения при 233 нм; триенов

— С = С — С = С — С = С — с максимумом поглощения 275 — 277

нм. В нативных жирных кислотах двойные связи не сопряжены, а

разделяются несколькими одинарными связями. Сопряженные

системы образуются в результате миграции двойных связей после

образования перекисной группы.

2.

На второй стадии окисления диены и триены распадаются до

промежуточных (вторичных) продуктов — альдегидов и кетонов.

53

Одним из соединений является

малоновый

диальдегид

(МДА), его реакция с тиобарбитуровой кислотой широко

используется для оценки состояния ПОЛ (Конторщикова, 2000).

Кроме того, образуется группа токсических альдегидов типа 4-

гидрокси-2-алкенали, 4,5-эпокси-2-алкенали, которые являются

стабильными соединениями, способными диффундировать в

окружающее пространство, вызывая повреждение биомолекул

(Gardner, 1989). При этом модификация белков и других

биомолекул продуктами пероксидации липидов занимает

центральное место при многих патологических состояниях

(Estenbauer, Schaur, Zollner, 1991). Другой продукт ПОЛ –

акролеин, может взаимодействовать с белками, образуя

карбонильные производные (Uchida, 1999).

3.

Вторичные продукты, в частности МДА, взаимодействуя с

аминогруппами (NH2) фосфолипидов и белков, входящих в состав

мембран, образуют полимерные флуоресцирующие соединения,

которые известны под названием оснований Шиффа. ОШ

выявляются методом флуоресценции при длине волны

возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 420 нм. Помимо ОШ,

к конечным продуктам относят также газообразные компоненты –

гептан, пентан, этан, октан, пропан, выявляемые методом газовой

хроматографии (Конторщикова, 2000).

4.

Простогландиноподобные конечные продукты («F-isoprostanes»)

(Frank, Pompella, Biesalski, 2000).

К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный

материал о биологической роли перекисей липидов (Ланкин, 1981). Так,

перекиси липидов используются организмом для синтеза простагландинов,

лейкотриенов и стероидных гормонов, определяют способность клеток к

миграции,

фагоцитозу,

дифференциации

и

слипанию,

регулируют

проницаемость клеточных мембран, участвуют в регуляции адреналовой

54

системы, сперматогенезе, являются эффекторами ряда ферментативных

реакций.

Продукты ПОЛ в низких концентрациях играют регуляторную роль в

обеспечении процессов восстановления в нервной ткани после возбуждения.

Для некоторых мембрановстроенных ферментов перекиси липидов

выступают в роли активаторов. Например, в малых дозах перекись линолевой

кислоты увеличивает активность фермента сукцинатдегидрогеназы.

Выделяют четыре основных аспекта метаболического влияния

эндогенных перекисей:

1.

При высоких концентрациях эндогенных перекисей липидов

значительное количество энергетического субстрата – ненасыщенных

жирных кислот – теряется для биоэнергетики, т.к. переводится из

русла ферментативного окисления в русло патогенетического

свободнорадикального окисления.

2.

Активация

свободнорадикального

окисления

приводит

к

качественному изменению состава липидных фракций мембран, что

вызывает изменение их физических свойств. В первую очередь

окисляются ненасыщенные «жидкие» липиды и остаются более

насыщенные, т.е. более «твердые». Это вызывает повышение вязкости

липидной фазы, что равносильно снижению температуры и

способствует снижению скорости всех ферментативных процессов.

При

кратковременных

периодах

повышения

активности

свободнорадикального окисления эти процессы под влиянием

антиокислителей обратимы и выполняют регуляторную роль. И,

напротив, длительная активация вызывает уменьшение эластичности и

механической прочности мембран (Владимиров, Арчаков, 1972).

3.

Изменение качественного состава липидов мембран оказывает

индивидуальное

влияние

на

активность

липидзависимых

мембрановстроенных ферментов (Меерсон, 1981). Поскольку каждый

фосфолипид служит специфическим эффектором для одного из

55

ферментов, нарушение их соотношений приводит к изменению

скоростей различных ферментативных реакций.

4.

Активация

свободнорадикального

окисления

и

накопление

гидроперекисей влияют на проницаемость мембран. Неокисленные

жирные кислоты в норме гидрофобны, т.е. создают непроницаемый для

воды и водорастворимых гидрофильных соединений двойной

гидрофобный слой в мембране. Гидроперекисные группировки

полярны и гидрофильны, при их образовании нарушается

гидрофобность

липидного

бислоя;

в

нем

формируются

гидрофильные поры. Нарушаются барьерные свойства мембраны,

она становится проницаемой, например, для гидролитических

ферментов или для ионов кальция, что активирует метаболизм живой

клетки (Владимиров, 1989; Владимиров и др., 1991).

При длительной активации тот же механизм приводит к разрушению

мембран и дезорганизации метаболизма.

1.2.2.Механизм окислительной модификации белков

Известно, что при окислительном стрессе радикальной атаке

активированных кислородных метаболитов (АКМ) подвергаются наряду с

липидами и клеточные белки (Дубинина и др., 1995).

Под свободнорадикальным окислением белков понимают их

посттрансляционную ковалентную модификацию, которая может быть

важной для ряда физиологических и биохимических процессов, таких как

старение, тканевой и энергетический обмен (Levine et al., 1990).

Аминокислоты, также как и состоящие из них белковые макромолекулы,

подвержены окислительному действию АКМ, что приводит к трем вариантам

изменения физико-химических свойств белков: фрагментации, агрегации и

подверженности протеолизу. В первую очередь, воздействию кислородных

радикалов подвергаются остатки пролина, гистидина и аргинина (Зенков,

Ланкин, Меньщикова, 2001; Рябов, Палечник, Азизов, 1991). Аминокислоты,

56

наиболее

чувствительные

к воздействию

окислителей

представлены в таблице 1.

Таблица 1

Аминокислоты, наиболее чувствительные к окислению и их главные

реакционные продукты (Stadtman, Levine, 2000).

Аминокислоты

Продукты окисления

Цистеин

Дисульфиды, смешанные дисульфиды

Метионин

Метионин-сульфоксид

Тирозин

Ди-, нитро-, хлортирозин

Триптофан

Гидрокси-, нитротриптофан

Фенилаланин

Гидроксифенилаланин

Валин, лейцин

Гидроксипероксиды

Гистидин 2-оксигистидин, аспарагин, аспартат

Глутамин

Щавелевая кислота, пируват

Пролин

Гидроксипролин, глутаминовый полуальдегид

Треонин 2-амино-3-кетомасляная кислота

Аргинин

Глутаминовый полуальдегид

Лизин

α-аминоадипиновый

полуальдегид,

хлорамины,

акролеин-лизин, карбоксиметилизин

В настоящее время предложены следующие механизмы ОМБ. Первый

механизм ОМБ – коньюгация липидных пероксидов с аминокислотными

остатками гистидина, цистеина и лизина в белках. Второй механизм –

окисление при участии АФК с образованием карбонильных производных, а

также дисульфидов Cys-S-S-Cys, цистеин-сульфеновой (SO), -сульфиновой

(SO2-) или -сульфоновой (SO3-) кислот, сульфоксида метионина (MetSO). В

последнее время к ОМБ предложено относить и гликирование и

гликоксидацию лизиновых и аспарагиновых остатков (Davies, Delsignore, Lin,

1987; Levine, 2002).

Процесс свободнорадикального окисления белков, так же, как и процесс

окисления липидов, носит цепной характер. В реакциях переходных

57

металлов

с

гем-содержащими белками продуцируются АКМ: О •¯

2 ,

НО2, Н2О2, •ОН, инициирующие цепной процесс с участием гемового

фрагмента белка. Инициирование цепей осуществляется путем переноса

электрона от иона металла на оксигенированную форму белка.

Полипептидная цепь активно вовлекается в дальнейшие реакции с

продуцированными в ходе процесса АКМ. Показано, что повреждение

полипептидной цепи осуществляется по цепному механизму без

разветвления цепи и включает 16 последовательных стадий. Радикалы и

молекулы кислорода участвуют в реакциях продолжения цепей, генерируя

органические перекиси. Основными радикалами, на которых происходит

обрыв цепей, являются генерированные из белковой молекулы, а также сами

АКМ, образующиеся при рекомбинации Н2О2 и О2. Конечными продуктами

окисления являются карбонильные фрагменты полипептидной цепи,

определяемые обычно в виде 2,4-динитрофенилгидразонов (Шугалей,

Лукогорская,

Целинский, 2002; Dean et al, 1997). Механизм

свободнорадикального окисления белков с образованием карбонильных

групп представлен на рисунках 1-3.

R

R

O

R

2

NH-CHCO

NH-C-CO

NH-C-CO

γ-лучи

O

OH

Fе3+ , ОН

O •

Fе2+

HO

Fе3+ + H+

2

H2O

H2O2

O2

Fе3+

R

O2

HO2

R

H2O + O2 HO2

R

NH-C-CO

NH-C-CO

NH-C-CO

OH

Fе2++H+

Fе3+

O •

Fе2+

Fе3+ + OH

O

O

H

Рис. 1. Окисление белков по свободнорадикальному механизму (Berlett, Stadtman, 1997).

H O O H O

| || || | ||

NH2-C-C-NH-C + O=C=N-C-C-

| | |

R1 R2 R3

H O •O O H O а

| || | || | |

NH2-C-C-NH-C-C-NH-C-C-

| | | б

R1 R2 R3 H O O O H O

| || || || | ||

NH2-C-C-NH2 + R2-C-C-NH-C-C-

| |

R1 R3

Рис. 2. Распад пептидной связи по диамидному (а) и α-амидному (б) пути (Berlett, Stadtman,

1997).

60

OH, HO2, O2

R1CONHCHCONHR

2

R1CONH2 + CH3COCONHR2 + COOH + H

2O2

(CH2)2

COOH

COOH

Рис. 3. Распад остатка глутамила с образованием щавелевой кислоты и производной

пировиноградной кислоты (Berlett, Stadtman, 1997).

61

В последнее время многие авторы склоняются к мнению, что в

состоянии окислительного стресса атаке АКМ подвергаются в первую

очередь белки плазматических мембран (Davies et al, 1999; Du, Gebicki, 2004)

из-за высокой чувствительности к свободным радикалам (Сolak, 2008).

Подтверждением этого может служить феномен - «молекулярная память

липидов». Суть его заключается в том, что многие краткосрочные события,

протекающие в белковых молекулах мембраны, влияют на долговременные

параметры функционирования мембранного бислоя липидов. При

воздействии соответствующего агента на мембранный белок-рецептор

конформация белков меняется, что приводит к изменению белок-липидных

контактов и модифицирует состояние липидов, окружающих белок. Эти

изменения сохраняются и после отщепления лиганда от рецептора, т.е.

служат способом закрепления рецептора в возбужденной конформации.

Таким образом, «память» липидов обеспечивает усиление сигнала,

передаваемого из внешней среды на клеточную мембрану через белок

(Болдырев, 1986).

Еще одним подтверждением первичности перекисного окисления белка

является наличие выраженных изменений при окислительном стрессе в

области анулярных липидов, что говорит о ведущей роли окислительной

модификации белков в деструкции клеточной мембраны (Арцукевич,

Мальцев, Зинчук, 2000).

При этом в отличие от продуктов пероксидации липидов, карбонильные

производные белков плазмы крови гораздо стабильнее, более специфичны,

что делает их удобным маркером интенсивности окислительного стресса

(Garcia-Garcia et al., 2012).

В свою очередь, И.А. Бондарь, В.В. Климонтов, И.А. Поршенников

(2000) показали, что образующиеся при СРО липидов продукты действуют

на белки как сильные окислители, повреждающее влияние которых

реализуется взаимодействием с SH-, NH2- и СН3-группами аминокислотных

62

остатков. Данный механизм лежит в основе инактивирующего влияния

липопероксидации на многие ферменты. Продукты окисления липидов могут

образовывать стабильные комплексы с белками и инициировать

полимеризацию белковых молекул, что в еще большей степени способствует

разрушению клеточных структур.

Обсуждение возможной окислительной деструкции белков в организме

до последнего времени носило, в основном, теоретический характер. В ряде

исследований этот процесс рассматривался как одна из возможных причин

инактивации ферментов, изменения структурной организации белков при

состоянии окислительного стресса (Davies, 1987; Salo et all., 1990).

Перекисное окисление – филогенетически древняя реакция, она

участвует в метаболических превращениях еще у простейших. Полагают, что

путем перекисного окисления одни виды простейших конкурируют с

другими видами; от простейших клетки рыхлой соединительной ткани

(нейтрофилы, моноциты, эндотелиальные клетки и макрофаги) унаследовали

способность синтезировать и секретировать во внеклеточную среду АФК

(Титов, 2002).

По мнению E.R.Stadtman, R.L.Levine (2000), агентами, приводящими к

окислению белков, являются:

1. Химические реагенты (глутатион).

2. Активаторы фагоцитоза (респираторный взрыв).

3. Гамма-излучение в присутствии кислорода.

4. Инфракрасное излучение, озон.

5. Липидные пероксиды (MДA, акролеин).

6. Утечка в электрон-транспортной цепи митохондрий.

7. Оксидоредуктазы

(ксантиноксидаза,

миелопероксидаза,

Р-450

фермент).

8. Лекарства и их метаболиты.

63

Помимо вышеперечисленных агентов к индукторам ОМБ можно

отнести непосредственно АФК, а также увеличение концентрации

свободного железа (Муравлева и др., 2010).

Биохимическими последствиями окислительной модификации белка

являются:

1. утрата или приобретение ферментативной активности (утрата

ингибиторной активности протеаз);

2. потеря функций белка (фибриноген→фибрин);

3. агрегация белков (Ig G);

4. изменение чувствительности к протеолизу;

5. изменения клеточных каналов;

6. модификация факторов транскрипции генов;

7. увеличение иммуногенности (Shacter, 2000).

Под действием АФК происходит разрушение белков с

образованием крупных агрегатов или фрагментация белковой молекулы.

Обычно гидроксильный радикал приводит к агрегации белковых молекул;

совместно с супероксиданионом гидроксильный радикал вызывает

фрагментацию белков до низкомолекулярных фрагментов. Радикалы

липидов также обуславливают фрагментацию белков. В основе механизма

агрегации белков лежит рост числа гидрофобных остатков на поверхности

глобул, что приводит к формированию крупных белковых конгломератов

(Davies, Delsignore, 1987).

В настоящее время стало известно, что активация ряда генов,

содержащих антиоксидант-респонсивные элементы, регулируется по

механизму карбонилирования. К таким генам относится, Например, Nrf2

(NF-E2-related factor 2) - основной транскрипционный фактор, вовлеченный в

регуляцию генов, содержащих антиоксидант-респонсивные элементы

(Walters, Cho, Kleeberger, 2008).

При окислении белков в большей степени обнаруживаются следующие

модификации структурных компонентов:

64

1. Карбонильные группировки белков (модификации в виде альдегид- и

кетогрупп боковых радикалов).

2. Связь между остатками тирозина.

3. Модификации триптофана.

4. Гидроперокси производные алифатических аминокислот.

5.Диаминирование,

образование

хлораминов,

хлорирование,

нитрозирование, гидроксилирование.

6.Взаимопревращение

аминокислот

(гистидин↔аспарагин;

пролин↔ОН-пролин).

7.Продукты аминокислотного окисления (p-идроксифенилацетальдегид).

8. Продукты ПОЛ (МДA).

9. Агрегация, расщепление связей пептидов (Stadtman, Levine, 2000).

Еще одной функцией карбонилирования белков, присутствующей в

норме, является так называемый контроль качества фолдинга белков.

Существует предположение, что развитие карбонилового стресса может

происходить и в отсутствие избыточной генерации АФК, угнетения АОС и

уменьшения протеазной активности. Этот путь ОМБ связан с продукцией

абберантных белков, образующихся при нарушении трансляции, дефиците

шаперонов,

действии

стресс-факторов,

например,

температуры

и

денатурирующих агентов. Цель данного процесса – деградация абберантных

белков с нарушенным фолдингом (Nyström, 2005).

Известно, что модификация белков делает их более чувствительными к

протеолизу. При этом существует мнение, что ОМБ является одной из

составляющих убиквитин-зависимого протеолиза (Тимофеева и др., 2012). В

рамках данной гипотезы элиминация карбонилированных белков может идти

двумя путями: с помощью протеасом и протеаз. В первом случае принимает

участие 20S убиквитин-независимая протеасома, которая разрушает белки с

нарушенным фолдингом. Механизм распознавания таких белков связан со

способностью протеосом определять участки глобул, на которых происходит

65

экспозиция гидрофобных радикалов. Это путь деградации многих

карбонилированных белков (Shringarpure et al., 2003).

Во втором случае, предположительно, снижение протеолиза вызвано

последовательной аккумуляцией агрегатов белков (агрегасом), устойчивых к

действию протеаз. Эти агрегасомы связываются с протеасомами и блокируют

их. Агрегаты с высоким молекулярным весом также ингибируют и протеазы

(Grune et al., 2004).

Е.А. Рассказовой, О.В. Плешаковой и В.Б. Садовниковым (2002) впервые

исследована специфичность протеаз нейтрофилов по отношению к

окисленным белкам, обнаружении изменения антигенных свойств и

чувствительности белков к действию протеаз в зависимости от содержания в

них карбонильных групп.

Наиболее важным следствием ОМБ является инактивация ферментов.

Например, альдегиды вызывают инактивацию мембранных транспортеров,

таких, как Na+-K+-ATP-азы, транспортеров глюкозы в головном мозге, что

приводит к нейродегенеративным расстройствам. Другим примером является

инактивация альдегидами шаперона Hsp90 и протеин-дисульфидизомеразы,

осуществляющих

контроль

фолдинга.

Альдегиды

чаще

всего

взаимодействуют с остатками цистиина или гистидина киназ, принимающих

участие в сигнальной трансдукции, что приводит к утрате их активности

(Carbone et al., 2005).

На настоящий момент существует мнение, некоторые альдегиды

способны активировать белки. Влияние некоторых альдегидов на процесс

воспаления, индукцию апоптоза может быть детерминировано через

сигнальные киназы по механизму loss- and gain-of-function modifications

(England, Cotter, 2005). Однако остается неясным способ организации и

регуляции процессов «направленного», или «целевого» карбонилирования

определенных белков путем увеличения концентрации АФК или активных

альдегидов, которые, как известно, не обладают избирательностью действия

(Муравлева и др., 2010).

66

Принято считать, что усиление свободнорадикального окисления

указывает на выход из-под контроля защитно-приспособительных реакций

организма на клеточном уровне и его гомеостатических систем в целом

(Кожевников, 1990; Bast, Halnen, Doelman, 1991).

Окислительное повреждение приводит к денатурации и агрегации

белковых молекул. Агрегация белков связана со способностью АКМ

образовывать межмолекулярные сшивки (Зенков, Ланкин, Меньшикова,

2001). Такого же мнения придерживается К. Девис (1987) (цит. по

Вьюшиной, Герасимовой, Флерову, 2002), который считает, что

патологическое усиление перекисных процессов связано с образованием

межмолекулярных сшивок и вызывает изменение физико-химического

состояния биомолекул. В результате денатурации белковых молекул

нарушается их конформация, и они становятся более уязвимыми к действию

протеолитических ферментов.

Влиянию АКМ одними из первых подвергаются SH-содержащие группы

белков; их окисление приводит к снижению содержания восстановленных

SH-групп, поэтому соотношение окисленных и восстановленных SH-групп

белковых молекул может быть использовано в качестве показателя развития

окислительного стресса (Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2001).

SH-содержащие соединения также могут вовлекаться в ферментативное

восстановление фенольных антиоксидантов (Афанасьева и др., 2007).

Тиолсодержащие соединения очень широко представлены в клетке в

виде глутатиона и других соединений, они участвуют практически во всех

биохимических процессах. Тиоловые группы присутствуют в клетке в двух

состояниях: восстановленном (-SH-) и окисленном (-SS-), причем

концентрация SH-групп в несколько раз выше концентрации SS-групп

(Соколовский, 1996).

По мнению R.L. Levine et al. (1990), SН-связи являются составной

частью антиоксидантной защиты.

67

Окисление тиоловых групп в отличие от других форм ОМБ является

обратимым процессом. Обратимое окисление/восстановление может

защищать белки от других, более сильных повреждающих форм

окислительной модификации, например, образования карбонильных

производных (Kemp, Go, Jones, 2008).

Н.М.Козлова, Е.И.Слобожанина, Е.А.Черницкий (1998) показали, что

окисление SH-групп мембранных белков эритроцитов человека диамидом

приводит к усилению везикуляции и образованию «антигенов старения» на

поверхности клеток. Процесс старения эритроцитов сопровождается

освобождением из клеток микровезикул, отражающим модификацию

поверхностных свойств эритроцитов. Предполагается, что одной из

возможных причин везикуляции может быть окисление мембранных белков

(Wagner et al., 1987).

Исходя из этого можно сделать вывод, что тиолдисульфидная система

реагирует на любое воздействие внутреннего или внешнего характера

изменением своего окислительно-восстановительного состояния. Это

состояние можно охарактеризовать соотношением концентрации -SH- и -SS-

групп – тиосульфидным равновесием, по сдвигам которого можно оценивать

общее антиоксидантное состояние клетки (Соколовский, 1996).

При развитии индуцированной молекулярно-клеточной деструкции в

биологических субстратах повышается содержание окисленных гемовых

белков, производных аминокислот и карбонильных групп (Halliwell, 1989).

Белки могут улавливать от 50% до 75% свободнорадикальных

соединений и являться высокоселективными маркерами окислительного

повреждения в тканях (Dean et al., 1997; Heinecke et al., 1999).

Карбонильные группы и гидроперекиси, образующиеся при окислении

белков, также могут служить показателями свободнорадикального окисления

(Зенков, Ланкин, Меньщикова, 2001; Greenacre, Ischiropoulos, 2001).

Существует мнение, что генерация карбонильных производных является

достаточно специфичным тестом, характеризующим уровень ОМБ (Blakeman

68

et al., 1995; Evans, Lyras, Halliwell, 1999). При этом кетон-

динитрофенилгидразоны являются более ранними маркерами окислительной

деструкции белка, а альдегид-дегидрофенилгидразоны – более поздними

(Курочкин и др., 2012).

Карбонильные производные белков являются стабильными продуктами,

которые образуются не только за счет окисления активными формами

кислорода

и

азота,

но

и

при

взаимодействии

продуктов

свободнорадикального окисления липидов с остатками аминокислот в

составе белков (Keiki, Wang, 2007). Такими аминокислотами являются

пролин, аргинин, лизина, треонин, в результате их взаимодействия с

продуктами ПОЛ происходит образование аддуктов Михаэля. Также

карбониловые производные белков могут образовываться при участии

аминокислотных остатков лизина, цистеина и гистидина с продуктами

перекисного окисления липидов. Причем карбонилирование аргинина и

лизина сопровождается потерей одного или более атомов азота. Кроме этого,

они могут образовываться в процессе гликирования/гликооксидации

аминогрупп лизина. По мнению ряда исследователей, карбониловые

производные формируются при металл-катализируемом окислении белков

(Grimsrud et al., 2008).

Индуктором ОМБ также является эндотелин-1, который взаимодействуя

с рецептором, способствует карбонилированию белков через образование

АФК (Cattaruzza, Hecker, 2008). Медиаторами этого процесса являются

пероксид и железо.

Установлено, что разные белки имеют различную устойчивость к

перекисному окислению (Shringarpure, Grune, Davies, 2001). Ф. Вонг и др.

(2001) изучили конформационные состояния шаперона GroEL (белка,

облегчающего фолдинг других белковinvivoи in vitro), обработанного

пероксидом водорода, с использованием белковой флюоресценции и

флюоресценции зонда – 8-анилино-1-нафталинсульфоната в дальнем

ультрафиолете. Полученные результаты указывают на высокую устойчивость

69

шаперона GroEL к окислительному стрессу. Четвертичная структура и

активность шаперона GroEL сохраняются даже при обработке 10 мМ

пероксидом водорода. При использовании более высоких концентраций

пероксида (>20 мМ) происходит расщепление шаперона GroEL на два

фрагмента. Предполагается, что GroEL как молекулярный шаперон имеет

отношение к окислительным процессамin vivo.

Пероксид водорода может проникать через биологические мембраны

почти как вода. Физиологическое значение пероксида водорода в организме

определяется его детоксикационными свойствами против чужеродных

веществ, а также ускорением транспорта глюкозы через плазматические

мембраны (Конторщикова, 2000).

In vitro показано, что продукты ОМБ опосредуют окислительные

повреждения ДНК (Пескин, 1997). ОМБ также приводит к снижению

функции белков в цепи переносчиков электронов, активности АТФ-азы,

избирательности действия транспортных пор. Изменение окислительно-

восстановительного потенциала митохондриальной мембраны может вызвать

дисфункцию каскада дыхательной цепи (Синицкая, Хавинсон, 2002).

Следовательно, окисленные белки являются не только «свидетелями», но

активными участниками свободнорадикального окисления клетки (Дубинина

и др., 2002).

1.2.3. Антиоксидантная система

Антиоксидантная система человека (АОС) – это система, блокирующая

образование высокоактивных свободных радикалов, т.е. активных форм

кислорода (Колесникова Л.И., Осипова Е.В, Гребенкина, 2011).

До настоящего момента не существует единой классификации АОС.

Уровни защиты клеток макроорганизма от активных форм кислорода могут

быть представлены следующим образом:

1-й уровень – системная защита клеток за счет значительного снижения

напряжения кислорода в тканях по сравнению с атмосферным воздухом;

70

2-й уровень – обеспечивается в процессе четырехэлектронного

восстановления основной массы внутриклеточного кислорода при участии

цитохромоксидазы без освобождения свободных радикалов;

3-й уровень – ферментативное удаление образовавшихся АФК;

4-й уровень – наличие ловушек свободных радикалов (антиоксидантов);

5-й уровень – ферментативное восстановление гидроперекисей

полиненасыщенных жирных кислот (Непряхина, 2009).

Ферментативные

антиоксиданты

характеризуются

высокой

специфичностью действия, а также клеточной и органной локализацией,

использованием в качестве катализаторов некоторых металлов (медь, цинк,

марганец, железо) (Рязанцева, 2011).

В

первую

очередь,

среди

ферментов

АОС

выделяют

супероксиддисмутазу (СОД) – антиоксидант, представляющий первое звено

защиты. Этот фермент находится во всех клетках, потребляющих кислород.

Роль СОД заключается в ускорении реакции превращения токсичного для

организма кислородного радикала – супероксида в перекись водорода и

молекулярный кислород. У млекопитающих известно три типа СОД:

цитозольная (Cu/Zn-СОД), митохондриальная (Mn-СОД) и внеклеточная

СОД (Levonen, Vahakangas, Koponen, 2008).

Еще одним из ключевых ферментов антиоксидантной системы является

каталаза, которая метаболизирует пероксид водорода, предотвращая его

накопление в клетке, с образованием воды и кислорода (Габитова, Рыжикова,

Рыжикова, 2006).

Фермент глутатионпероксидаза способствует вступлению перекисных

радикалов в реакцию друг с другом, результатом которой также является

образование воды и кислорода (Колесникова, Баирова, Первушина, 2013).

По данным E.R. Stadtman, R.L. Levine (2000) в клетке существует

специализированная система ингибирования окисления белков, в которую

включаются:

1. Антиоксиданты:

71

-скавенжеры (метионин)

-антиоксидантные ферменты (каталаза, супероксиддисмутаза,

пероксидазы)

-имитаторы антиоксидантных ферментов

-клеточные

низкомолекулярные

антиоксидантные

системы

(внутриклеточный глутатион)

2. Хелаторы

3. Недостаток кислорода.

Кроме биохимической, различают физиологическую систему защиты,

которая включает:

1.

Наличие каскада уровней рО2, понижающегося от альвеол к клеткам

со 100 – 105 до 8 – 10 мм рт. ст., т.е. в 1 – 13 раз.

2.

Уменьшение локального кровообращения в тканях при увеличении

рО2 в крови вовлечением в реакцию как системной гемодинамики,

так и микроциркуляции.

3.

Наличие относительно большой межкапиллярной дистанции и

высокого сродства цитохромоксидазы к О2 формирует еще один

градиент рО2 (Конторщикова, 2000).

Одним из детоксицирующих антиоксидантных ферментов является

глутатион-s-трансфераза (ГSТ), который за счет восстановленного

глутатиона осуществляет прямую регенерацию липоперекисей в мембранах,

без предварительного фосфолипазного гидролиза, снижая последствия

окислительного стресса и эндогенной интоксикации (Колесниченко,

Кулинский, 2000).

Конъюгация с глутатионом токсичных продуктов ПОЛ и ОМБ

способствует их выведению из организма (Tateishi, Wang, 2001). Система

обезвреживания с участием ГSТ и глутатиона играет уникальную роль в

формировании резистентности организма к самым различным воздействиям

и является наиболее важным защитным механизмом клетки (Кулинский,

Колесниченко, 1990). Недостаток ГSТ подвергает клетку риску

72

окислительного повреждения. Установлено, что дисбаланс в регуляции ГSТ

наблюдается при широком ряде патологий (Townsend, Tew, Tapiero, 2003).

Наиболее универсальная и важная сфера активности ГSТ – двойная

роль в защите от оксидативного стресса: восстановление АФК (кроме Н2О2)

и органических ROOH ПНЖК, фосфолипидов, белков, нуклеотидов и

нуклеиновых кислот и конъюгирование с восстановленным глутатионом

вторичных метаболитов окислительного стресса – альдегидов, хинонов,

эпоксидов (Кулинский, Колесниченко, 2009).

Сочетание антиоксидантных свойств и способности активировать

транскрипцию генов, в том числе некоторых антиоксидантных ферментов, а

также

ингибировать

редокс-зависимые

пути

активации

апоптоза

свидетельствуют о важном вкладе ГSТ в антиоксидантную защитную

систему, что повышает устойчивость клеток к окислительному стрессу

(Board, Menon, 2013).

Существенной является роль ГSТ в регуляции клеточного сигналинга

за счет белок-белковых взаимодействий с киназами, которые активируются

окислительным стрессом (Adler et al., 1999).

Среди литературы, посвященной теме данного раздела, наибольший

интерес представляют следующие исследования.

В последнее время многие авторы предлагают использовать

показатель активности ГSТ, как надежный маркер окислительного стресса

(Кантемирова, Сычев, Каркищенко, 2013) и развития и прогрессирования

различных заболеваний (Быков и др., 2013; Невзорова и др., 2012;

Федорович и др., 2014). В работе А.С. Поповой и соавторов (2013)

активность ГSТ определялась в пуповинной крови детей, относящихся к

группе риска по развитию пограничных и переходных состояний; авторами

сделан вывод, что ГSТ может быть надежным лабораторным маркером

напряжения системы детоксикации.

В работах последних лет присутствуют сведения о изменении

активности ГSТ при различных патологических состояниях. Повышение

73

активности фермента происходит при хронических гепатитах (Булатова и

др., 2014; Кулинский и др., 2007); токсическом отравлении (Баторова,

Колесниченко, 2010; Охремчук и др., 2011; Шипелин и др., 2013); целиакии

у детей (Успенская и др., 2013).

Снижение активности ГSТ наблюдается при раке легкого (Николаев и

др., 2013), психических расстройствах (Прохорова и др., 2015); хроническом

панкреатите (Меринова и др., 2013); остеомиелите (Колесниченко и др.,

2001).

Также существует информация, что активность ГSТ может изменяться

в зависимости от стадии заболевания. Так, при развитии экспериментального

гастрита уменьшение активности фермента происходит на ранних и поздних

этапах развития заболевания, напротив, в разгар заболевания активность ГSТ

увеличивается (Гайда и др., 2008).

В литературе отсутствуют сведения о определении ГSТ в сыворотке

крови при развитии лучевой болезни, однако интерес представляет

исследование А.У. Эминова (2011), посвященное определению глутатиона в

печени крыс после воздействия летальной дозы рентгеновского излучения.

Установлено, что содержание глутотиона после воздействия ионизирующей

радиацией резко снижается и с течением времени это понижение

усугубляется. Также М.М. Марченко, Г.П. Копыльчук и О.В. Кеца (2010)

показали, что воздействие рентгеновского облучения приводит к снижению

ферментативной активности ГSТ в микросомальной фракции печени у крыс-

опухоленосителей.

1.2.4. Патологические изменения, индуцируемые перекисным

окислением липидов и окислительной модификацией белков.

В результате многочисленных исследований последних лет накопился

большой фактический материал, демонстрирующий изменение катаболитов

ОМБ при различных патологических состояниях, также появился термин

«карбониловый стресс» (Муравлева, Молотов-Лучанский, Клюев, 2010).

74

Нарушение баланса между скоростью процессов образования

активных форм кислорода и мощностью антиоксидантной защиты

способствует самоускоряющемуся процессу ПОЛ, что приводит к полному

разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции

белков, нуклеиновых кислот и других молекул и, в конечном счете, к гибели

клеток (Колесова, Маркин, Федорова, 1984).

Прямую опасность представляет избыток (накопление свыше нормы)

активных свободных радикалов и продуктов ПОЛ — альдегидов и

оснований Шиффа: они нарушают клеточный метаболизм (Базанов, Боброва,

Соловьева, 1999). Существуют десятки факторов, инициирующих и

ускоряющих свободнорадикальное окисление за счет разветвления цепи.

Одними из распространенных являются термическая диссоциация

гидроперекисей (перегрев, ожог), а также действие ионов металлов

переменной валентности.

Причиной активации ПОЛ при радиационном поражении, прежде

всего, является внутриклеточное образование гидроксильных радикалов в

результате радиолиза воды с одновременной деструкцией белков –

антиоксидантов. При воспалительных реакциях имеет место усиленная

генерация активных форм кислорода фагоцитирующими клетками (Долгих и

др., 1988).

Гипоксия, сопровождающая многие патологические состояния,

характеризуется преимущественно одноэлектронным восстановлением

кислорода в митохондриях в результате его сниженного количества;

поступлением в кровь двухвалентного железа из его комплексов с белками;

снижением рН с изменением активности антиоксидантных ферментов;

поступлением в кровь из жировых депо свободных жирных кислот.

Активация ПОЛ при гипероксии, особенно сменяющей гипоксию,

объясняется значительным накоплением восстановленных переносчиков в

митохондриальной дыхательной цепи, что в присутствии кислорода создает

ситуацию подобную кислородному взрыву.

75

Необходимо отметить, что избыточная продукция свободных

радикалов и обусловленный ею оксидативный стресс являются важнейшими

механизмами инициирования и прогрессирования различных сердечно-

сосудистых заболеваний, в частности, атеросклеротического процесса и

ишемической болезни сердца (Fu et all., 1998).

Выход ОМБ из-под контроля так же, как и ПОЛ, может вызывать

различные патологические изменения в организме.

Наиболее характерными заболеваниями, которые индуцируются

свободнорадикальным окислением белков являются:

-атеросклероз (Ланкин, 1989; Давыденкова, Шафран, 1998; Ланкин,

Вихерт, 1989; Berliner, Heinecke, 1996; Uchida et al., 1994; Vinson, Teufel, Wu,

2001; Zwart et al., 1999),

-ревматоидный артрит (Chapman, Rubin, Gracy, 1989; Renke et al.,

2000),

-эмфизема, нейродегенеративные болезни (Frolich, Riederer, 1995;

Halliwell, 1992; Parihar et al., 1997; Parihar, Pandit, 2003; Taylor, Handy,

Fischbeck, 2002),

-болезнь Альцгеймера (Carney, Carney, 1994; Davies et al., 1988;

Hensley et al., 1994; Hensley et al., 1995; Sayre et al., 1997; Smith et al., 1998),

-болезнь Паркинсона (Alam et al., 1997; Carney, Carney, 1994; Floor,

Wetzel, 1998; Yoritaka et al., 1996),

-спорадический амиотрофический латеральный склероз (Andrus et al.,

1998; Bowling et al., 1993; Valentine, 2002),

-мышечная дистрофия (Murphy, Kehrer, 1992),

-легочная патология (Белоногов и др., 2009; Gladstone, Levine, 1994;

Quinlan, Evans, Gutteridge, 1994; Turi et al., 2004),

-острый панкреатит (Abu-Zidan, Bonham, Windsor, 2000),

-катаракта (Garland, 1990; Garland, Russell, Zigler, 1988; Garland, Zigler,

Kinoshita, 1986; Garner, Garner, Spector, 1983; Garner, Spector, 1980; Lund,

Smith, Smith, 1996),

76

-заболевания почек (Муравлева и др., 2010),

-диабет (Baynes, 1991; Baynes, 1994; Baynes, Thorpe, 1999; Jones,

Hothersall, 1993; Lung et al., 1993),

-прогерия (Oliver et al., 1987; Yu et al., 1997),

-сердечно-сосудистые заболевания (Хайбуллин, Кравцова, Мартынова,

2012),

-онкологические заболевания (Горошинская и др., 2013; Chih-Ching et

al., 2010), а также старение (Kato et al., 1998; Oliver et al., 1985),

К настоящему времени неоспоримо доказано, что развитие

онкологических заболеваний, СПИДа, воспалительных процессов, процессов

старения связано с нарастанием метаболизма активных форм кислорода с

последующим окислением белков (Шугалей, Лукогорская, Целинский,

2002).

В

патогенезе

варикозной

болезни

выявлена

важная

роль

биохимических нарушений, а именно функциональной недостаточности

антиоксидантной защиты организма. Даже физиологическое повышение

уровня оксирадикалов при мышечных нагрузках в вертикальном положении

обусловливает оксидативный стресс, индуцирует ангиогенез и создает

условия для варикоза поверхностных вен нижних конечностей (Трянкина,

Колобова, Варшавский, 2003). Локальное накопление в нижних конечностях

таких оксирадикалов, как супероксид, может выступать главным индуктором

синтеза

в

эндотелии

сосудов

эндотелиального

фактора

роста,

стимулирующего капиллярный ангиогенез. В венозных сосудах это может

приводить к удлинению, а затем и варикозной деформации поверхностных

вен (Цыпленкова, Бескровнова, 1996). При этом уровень продуктов ОМБ у

лиц с варикозным расширением вен имел тенденцию к повышению, однако

отличия оказались статистически недостоверными (Фомина, Шумская,

Фомина, 2011).

Протонная форма супероксидного анион-радикала легко проникает

через биологические мембраны и в организме играет роль кофактора во

77

многих жизненно важных процессах. Так, снижение его клеточной

концентрации имеет место при трисомии по 21 хромосоме и некоторых

психических расстройствах. Важна роль супероксидного анион-радикала

при воспалительных заболеваниях, аутоиммунных расстройствах, старении

и токсическом действии веществ. Он участвует в процессах синтеза

протромбина, коллагена, в распаде триптофана в головном мозге.

Уменьшение стационарной концентрации супероксиданионрадикала может

привести к недостатку синтеза дофамина. Снижение этого компонента имеет

место при шизофрении (Конторщикова, 2000).

О. Халдун и соавторы (2012) показали, что ОМБ вносит значительный

вклад в патобиохимическую картину крови больных с ожогами. При этом

активация процессов окислительного повреждения белков плазмы крови при

ожоговой болезни может быть результатом не только усиленного

образования кислородных радикалов, но и следствием нарушения

функционирования механизмов антирадикальной защиты тканей, в том числе

и крови, с участием супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и

каталазы, уменьшения содержания церулоплазмина (Рябинин, Лифшиц,

1990).

Установлено, что различные токсические вещества влияют на процесс

перекисного окисления белков (Гонский и др., 1996) . С.О. Бурмистров и др.

(2001) изучали влияние ингаляций толуола и диоксана на интенсивность

свободнорадикального окисления в ткани яичников и коры больших

полушарий мозга крыс и показали, что оба интоксиканта в дозе 10 предельно

допустимых концентраций повышали активность глутатионпероксидазы в

ткани мозга, а толуол повышал уровень хемилюминесценции, что позволило

сделать вывод об усилении активности свободнорадикальных процессов. В

ткани яичников под влиянием толуола происходило повышение активности

глутатионпероксидазы, каталазы и интенсивности ОМБ.

В настоящее время уделяется внимание исследованию продуктов ОМБ

у новорожденных детей и беременных женщин. Так, у беременных женщин

78

с плацентарной недостаточностью наблюдается интенсивная деструкция

белков плаценты (содержание альдегид- и кетон-денитрофенилгидразонов

на 62% превышало нормальные показатели). Динамика содержания этих

гидразонов в значительной мере определяет исход беременности (Губский и

др., 2005). Также установлено, что прогрессирование токсикоза

сопровождается увеличением содержания карбонильных производных ОМБ

и снижением активности каталазы в плазме крови беременных женщин

(Акбашева и др., 2012). Кроме того, другой коллектив авторов отмечает

отсутствие достоверных различий в уровне ОМБ у здоровых беременных и

здоровых небеременных женщин (Шевелькова, Вьюшина, 2012). В работе

М.Ю. Курочкина и соавторов (2012) показана зависимость содержания

продуктов спонтанной и индуцированной ОМБ у оперированных

новорожденных от вида анестезии. Существуют данные, свидетельствующие

о высокой прямой корреляционной связи между показателями ОМБ у детей

и их матерей. Также ОМБ не зависит от способа родоразрешения (Евсюкова

и др., 2011).

В литературе присутствуют сведения о повышении уровня продуктов

ОМБ в сыворотке крови, эритроцитах и слюне больных дерматозами.

Выявлена высокая степень общей ОМБ у больных псориазом и атопическим

дерматитом и пузырчаткой (Копытова и др., 2014). Окислительная

деструкция белков является доклиническим индикатором повреждения ткани

при формировании атопического дерматита у детей грудного возраста

(Безрукова, Джумагазиев, Степина, 2011).

Установлено, что стресс, депрессия и другие психические

расстройства также вызывают усиление перекисного окисления белков

(Барабой, 1989). Е.Е. Дубинина и соавторы (2000) выявили повышение

интенсивности ОМБ у больных с нарушением психики по сравнению со

здоровыми людьми. У больных с деперсонализационным синдромом

окисленные белки содержат высокий уровень битирозина, у них более

выражена степень фрагментации по сравнению с депрессивными больными.

79

При депрессии окислительный стресс, как и общая стрессорная реакция

организма, носит хронический характер. Возможно, в этих условиях

окисленные белки и пептиды больше подвержены протеолизу.

Динамика окислительной модификации белков при стрессе зависит не

только от биохимических процессов и от внешних стрессовых факторов, но

и от стратегии поведения при этом состоянии (Завалишин, Захарова, 1996).

А.В. Вьюшина, И.Г. Герасимова, М.А. Флеров (2002), изучая ОМБ

сыворотки крови у крыс с разной стратегией адаптивного поведения в

условиях покоя и краткосрочного иммобилизационного стресса, установили,

что процессы окислительной деструкции белков более интенсивны у

животных с активным поведением. Кроме того, нарушения процессов ОМБ в

стриатуме, гипоталамусе и гиппокампе под влиянием пренательного стресса

могут быть одной из причин изменений адаптивного поведения у взрослых

пренатально стрессированных животных (Вьюшина, Притворова, Флеров,

2012).

Аналогичные исследования проводились у беременных крыс,

селектированных по порогу возбудимости нервной системы. А.В. Вьюшина

и соавторы (2002) обнаружили различия в интенсивности ОМБ сыворотки

крови у беременных крыс с высоким и низким порогом возбудимости

периферической нервной системы при стрессе. Так, если у крыс с высоким

порогом возбудимости наблюдается увеличение содержания продуктов

стимулированной ОМБ при стрессе, то у крыс с низким порогом

возбудимости этот показатель снижается.

В многочисленных исследованиях показано, что интенсификация ОМБ

наблюдается при опухолевом поражении различных органов. При

прогрессировании рака яичников с формированием рецидивной опухоли,

усилением ее васкуляризации и интенсификацией опухолевого кровотока в

крови происходят закономерные волнообразные изменения окислительного

статуса крови, приводящие к дальнейшему развитию карбонильного стресса

(Горошинская и др., 2013). Данная динамика изменения содержания

80

продуктов ОМБ получена и при экспериментальном раке яичников

(Насырова и др., 2015) и раке вульвы (Горошинская и др., 2014). В ткани

опухоли происходит снижение содержания исследованных показателей, что

свидетельствует об уменьшении интенсивности свободнорадикального

окисления и высокой резистентности опухолевых клеток к окислительному

стрессу (Белоногов, Титова, Дыхно, 2010). Напротив, в эритроцитах

пациентов при раке яичников происходит повышение содержания продуктов

ОМБ по сравнению с практически здоровыми женщинами (Долгова и др.,

2014).

И.А. Бондарь, В.В. Климонтов, И.А. Поршенников (2000) установили

зависимость степени карбонильной модификации белков сыворотки крови у

больных сахарным диабетом 1 типа в зависимости от качества

гликемического контроля, интенсивности процессов липопероксидации и

наличия микроангиопатий. Авторы пришли к выводу, что у больных

сахарным диабетом 1 типа, осложненном ретино- и/или нефропатией, наряду

с гипергликемией и интенсификацией свободнорадикального окисления

липидов, наблюдается накопление в сыворотке крови модифицированных

белков с повышенным количеством карбонильных групп (Дзугкоев,

Карсанова, Гурина, 2002).

Это подтверждается в работе М. А. Флерова, Н. Н. Смирновой и З. В.

Светловой (2003), где была изучена окислительная деструкция белков

плазмы крови детей, больных сахарным диабетом типа 1, и практически

здоровых

детей.

При

определении

степени

спонтанного

и

металлкатализируемого окисления белков по реакции взаимодействия

окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином было

показано, что в плазме крови больных сахарным диабетом типа 1 по

сравнению со здоровыми повышен уровень продуктов перекисного

окисления.

В исследованиях последних лет установлено, что у потомков самок с

экспериментальным

гестационным

диабетом

концентрация

81

кетонфенилгидразонов в плазме крови практически достигает концентрации

альдегидфенилгидразонов, что, возможно, свидетельствует о «срыве»

резервно-адаптационных возможностей организма (Ганчева, 2015).

С.К. Соодаевой (2002) была произведена оценка глубины

окислительного повреждения белков у больных хронической обструктивной

болезнью легких. Выявлено достоверное увеличение уровней продуктов

ОМБ по сравнению со здоровыми людьми. М.Н. Палей и соавт. (2014)

показано, что интенсификация спонтанной и индуцированной ОМБ является

ранним

признаком

окислительного

стресса

и

может

служить

диагностическим критерием начавшегося повреждения дыхательных путей

еще до развития клинической картины хронической обструктивной болезни

легких.

Исследования окислительной модификации белков проводились и при

других патологических состояниях.

В.И. Орловым и соавторами (2004) изучена интенсивность

окислительной деструкции белков у женщин детородного возраста с

синдромом поликистозных яичников на фоне гипоталамического синдрома

после хирургического лечения. В ходе исследования сделаны выводы о

возможности использования показателей ОМБ для оценки эффективности

лечения этого заболевания.

У больных гепатитом В и С повышалась интенсивность процессов

ОМБ и ПОЛ (Шувалова, Антонова, 1997; Журкин, Дубинина, Гундалах,

1986). Даже при легком течении болезни альдегид- и кетон-

денитрофенилгидразоны основного характера превышали норму в среднем

на 33,6%, а нейтрального характера – на 15-20%. Степень окисления белков

зависит от активности воспалительного процесса в печени и длительности

заболевания. (Березенко и др., 2012; Губский и др., 2005).

В настоящее время обсуждается возможная связь ОМБ эритроцитов с

морфологическими изменениями клеток при алкоголизме. В.Д. Прокопьевой

и соавторами (2005) обнаружено существенное увеличение количества

82

карбонилированных белков как в плазме крови, так и в препаратах теней

эритроцитов пациентов. Выраженность процесса карбонилирования белков

имеет взаимосвязь с тяжестью проявлений абстинентного синдрома и более

выражена у пациентов женского пола (Мингазов и др., 2013).

Установлено, что разные ткани, а также ткани, находящиеся на

различных этапах онтогенеза, обладают различной чувствительностью к

окислительному стрессу (Dolle et al., 1997). Некоторые ткани (мозг, сетчатка,

легкие) обладают повышенной чувствительностью к окислительному

стрессу, что связано с особенностью их химического строения и

метаболизма. Повышенная чувствительность мозговой ткани обусловлена

высокой

степенью

насыщения

кислородом,

преобладанием

полиненасыщенных жирных кислот, присутствием «активной формы»

железа и низкой активностью отдельных звеньев ферментативной

антиоксидантной защиты, в частности, каталазы (Дубинина и др., 2000).

В литературе отсутствуют четкие представления о возрастных

изменениях свободнорадикального окисления белков в первой половине

онтогенеза при окислительном стрессе. Р.В. Козовый и Г.М. Эрстенюк

(2014) выявили, что интенсификация процессов ОМБ у долгожителей

сопровождается увеличением альдегидо- и кетонопроиздных основного

характера по сравнению с лицами зрелого возраста. Предположительно,

полученные

результаты

могут

свидетельствовать

о

лучшем

функционирования у долгожителей защитных противорадикальних систем

по сравнению с лицами зрелого возраста.

Впервые свободнорадикальная теория старения была сформулирована

D. Harman и развита в последующих его работах (Harman, 1956; Harman,

1968; Harman, 1988; Harman, 1991; Harman, 1992; Harman, 1994; Harman,

1996). В дальнейшем его теория была подтверждена в многочисленных

работах при исследовании пожилых людей и в опытах на старых животных

(Beckman, Аmes, 1998; Martinez-Cayuela, 1995; Sohal, 2002; Yu, 1996).

83

Теория

накопления

липофусцина

(старческого

пигмента),

являющегося продуктом перекисного окисления белков, связывает развитие

старения с накоплением липофусцина в клетках наиболее аэробных тканей –

сердца и головного мозга (Кольтовер, 1998; Тишевской, 2000).

Сведения о возрастных изменениях в разных тканях противоречивы,

что может быть обусловлено как различиями в объектах изучения,

особенностями пищевого режима животных, так и выбранными для

сравнения возрастными периодами (Анисимов и др., 1999; Коркушко и др.,

1996; Cutler, 1991). И.А. Волчегорским и соавторами (2007) при

исследовании процесса постнатального развития человека обнаружено

возрастное увеличение уровня продуктов ОМБ, достигающее максимума к

12-21 годам, наиболее выраженное (4-6-кратное) в зрительной коре,

гиппокампе, диэнцефальных и понтобульбарных отделах головного мозга.

Сейчас все больше склоняются к мнению, что наиболее значимым при

старении оказывается усиление ОМБ, а не липидов, чему способствует

снижение активности СОД при интенсификации общей продукции АКМ

(Крутько и др., 2001). В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов и В.Н. Анисимов (1999)

считают наиболее уязвимой мишенью свободных радикалов при старении

мембранные белки, что находит отражение в увеличении скорости их

пероксидации в сыворотке крови и в печени. Однако подобные изменения

отсутствуют при старении в мозге, что может быть в какой-то мере связано с

высокой активностью низкомолекулярных антиоксидантов, поскольку

общая антиокислительная активность в мозгу старых крыс не изменяется.

Ю.И. Губским и соавторами (1989) установлено, что в головном мозге

старых крыс существенно снижена активность СОД по сравнению с

молодыми – на 48,6%. Концентрация продуктов окислительной

модификации белков увеличивалась, тогда как уровни диеновых конъюгатов

и оснований Шиффа не изменялись. В печени старых крыс наблюдалось

существенное увеличение продуктов ОМБ – на 109,2% и оснований Шиффа

– на 27,1%, а также значительное снижение активности СОД. Уровень

84

диеновых конъюгатов и общая антиоксидантная активность не изменялись.

Другая динамика возрастных изменений параметров свободнорадикальных

процессов наблюдалась в сыворотке крови. Так, у старых крыс было

отмечено существенное увеличение продуктов ОМБ. При этом значительно

снижалась активность СОД и общая антиоксидантная активность.

В ряде других исследований также было установлено, что при

старении, в первую очередь, усиливается ОМБ, причем более интенсивно по

сравнению с ПОЛ. Так, Ю.И. Губский и соавторры (2005) исследовали

возрастные изменения продуктов ПОЛ и ОМБ в митохондриях и

микросомах печени преждевременно стареющих крыс OXYS по сравнению с

соответствующими показателями крыс линии Вистар. В течение первого

года жизни в митохондриях и микросомах клеток печени крыс обеих линий

наблюдались нелинейные разнонаправленные изменения содержания

продуктов ОМБ и ПОЛ. К 12 месяцам в митохондриях и цитозоле клеток

крыс OXYS уровень окислительных повреждений белков выше, чем у

Вистар. При этом повышенное содержание продуктов ПОЛ наблюдалось

только в митохондриях, в то время как в микросомах печени крыс OXYS

содержание и первичных, и конечных продуктов ПОЛ к 12 месяцам жизни

животных существенно снижалось, а концентрация продуктов ОМБ

достоверно увеличивалась.

В последние годы в литературе накоплены многочисленные данные об

активации и особенностях процессов ПОЛ и ОМБ при различных видах

сердечно-сосудистой патологии (Pantke et al., 1999; Turner et al., 1991), в

особенности при атеросклерозе (Ланкин, 1989; Давыденкова, Шафран, 1998;

Vinson, Teufel, Wu, 2001; Zwart et al., 1999) и ишемии миокарда (Rouslin,

Ranganathan, 1983; Vanden Hoek et al., 1997).

Широко изучаются процессы ОМБ при ишемических инсультах.

Известна динамика содержания продуктов ОМБ при остром ишемическом

инсульте (Хайбуллин, Кравцова, Мартынова, 2012). Отрицательный

показатель корреляции между показателями ОМБ и неврологическим

85

дефицитом свидетельствует об уменьшении неврологического дефицита на

фоне уменьшения окислительного стресса у пациентов с ишемическим

инсультом.

Установленная

взаимосвязь

позволяет

использовать

динамические показатели ОМБ в качестве маркера прогноза заболевания и

эффективности лечения (Кравцова, Мартинова, Кравцов, 2011).

Также

известна

роль

интенсификации

свободнорадикальных

процесслов при развитии нейродегенеративных заболеваний. Л.М. Овсепян

и соавторы (2012) выявили повышение содержания продуктов ПОЛ и ОМБ

при экспериментально вызванном синдроме болезни Паркинсона.

Не смотря на многообразие российских и зарубежных исследований,

посвященных изучению роли ОМБ и ПОЛ при различных заболеваниях и

альтерации органов и тканей, в литературе отсутствуют сведения о

измерении продуктов ОМБ в тканях животных, переживших облучение

ионизирующей радиацией, высокоинтенсивным лазерным излучением и

асфиксию.

Существует ряд работ, заслуживающих особого внимания при

написании данной главы.

К ним относится исследование И.К. Томиловой и соавторов (2009),

показавшей, что в головном мозге новорожденных крысят после

антенатальной гипоксии наблюдается интенсификация процессов ПОЛ. При

изучении влияния острой циркуляторной гипоксии, вызванной кровопотерей

в эксперименте, показано, что гипоксия инициирует увеличение ПОЛ и

изменение активности ферментов АОС (Генинг, Ксейко, 2004; Ксейко,

Генинг, 2012).

На данный момент известно, что основой деструктивного действия

ионизирующего излучения являются цепные свободнорадикальные реакции,

сопровождающиеся активацией ПОЛ и ОМБ. Однако в литературе

представлены

лишь

отрывочные

сведения

по

исследованию

свободнорадикальных процессов в тканях при их альтерации ионизирующей

радиацией.

86

Интерес представляет работа по изучению действия ионизирующего

излучения в дозе 1,0 Гр на ОМБ и ферменты АОС. Авторами установлено,

что

радиация

вызывает

активацию

прооксидантного

фермента

ксантиноксидазы в лимфоцитах селезенки, что сопровождается повышением

скорости образования супероксидных анион-радикалов и свидетельствует об

участии ксантиноксидазной системы в индуцированой радиацией гибели

клеток. Также показано увеличение степени ОМБ в спленоцитах через 3 часа

после тотального облучения крыс (Ракша, Андрийчук, Кучеренко, 2006).

А.М. Кирпиной и соавторами (2011) убедительно показано, что

альтерация тканей крыс гамма-излучением в дозе 6 Гр вызывает

отрицательные изменения концентраций ДК и МДА в лимфоцитах,

гомогенатах селезенки, печени и лимфоузлов.

При развитии радиационного поражения печени, вызванного

облучением гамма-излучением в дозе 9 Гр, содержание ДК в гомогенатах

печени превышает исходный уровень в 4 раза, при этом интенсивность

накопления МДА в гомогенатах печени проявляется менее значительно

(Гурьянова, Тарасова, 2013). Кроме того, существует экстремальная

зависимость между содержанием продуктов ПОЛ в печени контрольных

мышей и их изменением через 1 сутки после облучения (Кушнирева,

Полякова, Шишкина, 1998).

Напротив, облучение в меньших дозах (5 Гр) подавляет процессы ПОЛ

в сердце, печени, почках и в тощей кишке мышей (Кашина Т.П., 2003).

Однако при комбинированном воздействии гамма-излучением в дозе 2 Гр и

хризотил-асбестовой пылью повышается содержание ДК и МДА в печени,

клетках лимфоузлов тонкого кишечника, селезенке, тимусе, надпочечниках

и лимфоцитах периферической крови крыс (Жетписбаев, Кашанский,

Ильдербаев, 2007).

Ю.В. Саенко и соавторы (2012) получили интересные данные по

динамике генерации АФК в раковых клетках после облучения

ионизирующей радиацией. Первый максимум наблюдается через 30 минут

87

после облучения и превосходит концентрацию АФК контрольных клеток в

1,35 и 1,67 раза при облучении клеток дозами 4 и 12 Грей, соответственно.

При определении концентрации АФК через 4 часа после облучения,

оказалось, что она практически не отличается от таковой в контрольных

клетках. Через 8 часов концентрация АФК в клетках, подвергшихся

облучению, была в 1,1 и 1,21 раза больше, но статистически незначимо

отличалась от таковой в контрольных клетках. Далее наблюдался рост

концентрации АФК. Через 24 часа после облучения отмечался второй

максимум внутриклеточной концентрации АФК, который превосходил по

своим значениям первый максимум, наблюдавшейся через 30 минут после

облучения. При облучении клеток дозой в 4 Гр концентрация АФК в 1,83

раза превосходила аналогичный параметр в контрольной группе, и в 2,16

раза, если клетки подвергались облучению в дозе 12 Гр. Через 48 часов после

облучения,

происходило

некоторое

снижение

внутриклеточной

концентрации АФК. Дальнейший мониторинг концентрации АФК в

культурах клеток, подвергшихся облучению, авторами был признан

нецелесообразным в связи со старением среды и накоплением большого

количества погибших клеток, что препятствовало точному определению

концентрации АФК в клеточных культурах старше 48 часов. Таким образом,

было установлено, что после облучения в дозах 4 и 12 Гр в раковых клетках

АФК генерируются циклически с двумя максимумами через 30 минут и 24

часа после облучения

Известно, что облучениеin vitro суспензии плазматических мембран,

ядер, митохондрий, микросом и лизосом сопровождается усилением в них

ПОЛ (Древаль, 1996; Поливода, Конев, Попов, 1990).

Таким образом, ОМБ играет ключевую роль в молекулярных

механизмах окислительного стресса и является пусковым механизмом к

окислительной деструкции других молекул клетки. Изучение ОМБ и ПОЛ

представляет огромный интерес в связи с вызываемыми ими заболеваниями,

ставшими на данный момент болезнями 21 века, такими как болезнь

88

Альцгеймера, болезнь Паркинсона и многие другие. В связи с этим, его

продукты являются маркерами раннего оксидативного стресса, то

дальнейшее

исследование

этого

процесса

будет

способствовать

совершенствованию мер диагностики и лечения ряда перечисленных выше

патологических состояний.

89

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Постановка опыта и объект исследования

Материалом для исследования служили ткани белых нелинейных

самцов крыс массой 180-250 г. (сыворотка крови, легочная, сердечная и

мышечные ткани).

Общее количество материала и его распределение по этапам

исследования представлено в таблице 1.

Таблица 2

Общее количество материала и его распределение по этапам

исследования

Этапы исследований

Экспериментальные

Вид

Количество

п/п

методы

биологическог

исследований

о материала

1.

Действие

Анализ ЭКГ 107

широкополосного

Определение

степени Сыворотка

57

красного света после спонтанной ОМБ

крови

альтерации

области

Миокард

39

сердца крыс гамма-

Легочная ткань 57

излучением (57 крыс) Определение

степени Сыворотка

57

металл

катализируемой крови

ОМБ

Миокард

39

Легочная ткань 57

Определение общего белка Сыворотка

57

крови

Миокард

39

Легочная ткань 57

Определение содержания Сыворотка

54

продуктов ПОЛ

крови

Миокард

39

Легочная ткань 54

Определение активности Сыворотка

57

ГSТ

крови

Электронно-

Миокард

667

микроскопические

исследования

2.

Действие

Определение

степени Мышечная

30

широкополосного

спонтанной ОМБ

ткань

красного света после Определение

степени Мышечная

30

альтерации

металл

катализируемой ткань

мышечной

ткани ОМБ

крыс

гамма- Определение общего белка Мышечная

30

излучением (30 крыс)

ткань

90

Определение содержания Мышечная

25

продуктов ПОЛ

ткань

Электронно-

Мышечная

377

микроскопические

ткань

исследования

3.

Действие

Определение

степени Мышечная

30

широкополосного

спонтанной ОМБ

ткань

красного света после

Сыворотка

30

альтерации

крови

мышечной

ткани Определение

степени Мышечная

30

крыс

металл

катализируемой ткань

высокоинтенсивным

ОМБ

лазерным излучением

Сыворотка

30

-лазер

красного

крови

диапазона (30 крыс)

Определение общего белка Мышечная

30

ткань

Сыворотка

30

крови

Определение содержания Мышечная

30

продуктов ПОЛ

ткань

Сыворотка

30

крови

Определение активности Сыворотка

30

ГSТ

крови

Электронно-

Мышечная

376

микроскопические

ткань

исследования

-лазер инфракрасногоОпределение

степени Мышечная

30

диапазона (30 крыс)

спонтанной ОМБ

ткань

Сыворотка

30

крови

Определение

степени Мышечная

30

металл

катализируемой ткань

ОМБ

Сыворотка

30

крови

Определение общего белка Мышечная

30

ткань

Сыворотка

30

крови

Определение содержания Мышечная

30

продуктов ПОЛ

ткань

Сыворотка

30

крови

Определение активности Сыворотка

30

ГSТ

крови

4.

Действие

Анализ ЭКГ 297

широкополосного

Определение

степени Сыворотка

73

красного света после спонтанной ОМБ

крови

альтерации сердечной

Миокард

73

и легочной ткани

Легочная ткань 70

крыс

наложением Определение

степени Сыворотка 73

91

асфиксии (73 крысы)

металл

катализируемой крови

ОМБ

Миокард

73

Легочная ткань 70

Определение общего белка Сыворотка

73

крови

Миокард

73

Легочная ткань 70

Определение содержания Сыворотка

65

продуктов ПОЛ

крови

Миокард

73

Легочная ткань 73

Определение активности Сыворотка

66

ГSТ

крови

5.

Всего исследований

4067

Моделирование развития радиационно-индуцированной болезни сердца

осуществляли путем локального облучения области сердца крыс. Доза

облучения составила 9 Гр. Облучение проводилось на установке «Луч-1»

(энергия гамма-квантов, получаемых при распаде кобальта 60, имела два

пика: 1,17 и 1,33 МэВ). Световое облучение широкополосным красным

светом области сердца проводили в течение 20 минут. Интенсивность света в

зоне светового пятна была равна 5 мВт/см2. В эксперименте использовался

широкополосный свет сверх яркого светодиода с максимумом спектрального

диапазона 630 нм и шириной на полувысоте 20 нм. При прохождении через

грудину интенсивность света снижалась на 20%. Животные были разделены

на 5 групп: «контроль» - облучение области сердца гамма-излучением, забор

материала и снятие ЭКГ на следующие сутки; «опыт» - облучение области

сердца гамма-излучением + один сеанс облучения широкополосным красным

светом, забор материала и снятие ЭКГ на следующие сутки; «хронический

контроль» - облучение области сердца гамма-излучением, забор материала и

снятие ЭКГ на четвертые сутки; «хронический опыт» - облучение области

сердца гамма-излучением + четыре ежедневных сеанса облучения

широкополосным красным светом, забор материала и снятие ЭКГ на

четвертые сутки; «норма» - не подвергалась воздействию ни гамма-

излучения, ни широкополосного красного света.

92

Радиационное облучение мышечной ткани также проводили с помощью

установки «Луч-1». Облучению подвергалась внутренняя сторона бедра

опытного животного площадью 1 см2, доза облучения ионизирующей

радиацией составляла 9 Гр. Световое облучение внутренней поверхности

бедра крыс широкополосным красным светом проводили по схеме

предыдущего эксперимента, сеанс облучения также составлял 20 минут. При

При прохождении через кожу интенсивность света снижалась на 5%. Крысы

были разделены на 3 группы: «контрольная группа» - облучение внутренней

поверхности бедра гамма-излучением, забор материала на четвертые сутки;

«опытная группа» - облучение внутренней поверхности бедра гамма-

излучением + три ежедневных сеанса облучения широкополосным красным

светом, забор материала на четвертые сутки; «интактная группа» - не

подвергалась воздействию ни гамма-излучения, ни широкополосного

красного света.

Эксперименты по влиянию широкополосного красного света после

альтерации мышечной ткани крыс высокоинтенсивным лазерным

излучением осуществляли с помощью высокоинтенсивных лазеров красного

диапазона (длина волны 671 нм) и инфракрасного диапазона (длина волны

980 нм). Мощность обоих лазеров составляла 50 мВт. Облучению лазерным

светом высокой мощности подвергалась внутренняя поверхность бедра крыс,

зона облучения была разделена на 9 полей площадью 1 мм2 каждое, время

экспозиции каждого поля составляло 5 минут, интенсивность излучения

лазера в месте светового пятна составляла 0,55 Вт/см2. Параметры

широкополосного красного света соответствовали таковым в предыдущих

экспериментах. В ходе экспериментов для каждого вида лазера были

выделены 3 группы животных: «контрольная группа» - облучение

внутренней поверхности бедра мощным лазерным излучением, забор

материала на третьи сутки; «опытная группа» - облучение внутренней

поверхности бедра мощным лазерным излучением + три ежедневных сеанса

облучения широкополосным красным светом, забор материала на третьи

93

сутки; «интактная группа» - не подвергалась воздействию ни мощного

лазерного излучения, ни широкополосного красного света.

Моделирование

асфиксии

проводилось

с

помощью

мягкой

конусообразной запаянной трубки, диаметр которой соответствовал

диаметру трахеи крыс. Трубка вставлялась через ротовое отверстие и

перекрывала поступление воздуха через трахею и носоглотку. Облучение

области сердца и легких широкополосным красным светом с интенсивностью

5 мВт/см2 осуществлялось через трахею с помощью полимерного световода

(ширина спектра на полувысоте 70 нм, длина волны в пике спектра 640 нм).

В данном эксперименте выделено 3 группы животных: 1 группа – норма – не

подвергалась ни нанесению асфиксии, ни воздействию широкополосного

красного света; 2 группа – контроль – нанесение двухминутной асфиксии; 3

группа – опыт – нанесение двухминутной асфиксии + воздействие

широкополосным красным светом в течение 10 минут. Снятие ЭКГ

начиналось до нанесения асфиксии (норма), затем во время нанесения

асфиксии, сразу после и далее каждые пять минут до наступления получаса

после начала опыта (контроль). Освещение широкополосным красным

светом в опытной группе начинали сразу после нанесения асфиксии, снятие

ЭКГ проводили в режиме контрольной группы. Забор материала в опытной и

контрольной группах проводился через час после нанесения асфиксии.

2.2. Методы исследования

2.2.1. Определение степени окислительной модификации белков по

уровню карбонильных производных

Принцип метода определения степени ОМБ по уровню карбонильных

производных

основан

на

реакции

взаимодействия

окисленных

аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ)

с образованием производных 2,4-динитрофенилгидразона (Дубинина и др.,

1995).

94

К 0,1 мл сыворотки крови или гомогената ткани добавляли 1 мл 0,01 М

раствора 2,4-ДНФГ в 2 н HCl и выдерживали в течение часа, встряхивая

через каждые 15 минут. Денатурацию белков осуществляли с помощью 1мл

20% раствора трихлоруксусной кислоты. Денатурированные белки осаждали

с помощью центрифугирования при 3000 g в течение 20 минут. Осадок

отмывали от непрореагировавшего красителя и липидов смесью этанол:

этилацетат (1:1), подсушивали и добавляли 3 мл мочевины, смесь кипятили

на водяной бане в течение 10 минут. Оптическую плотность образовавшихся

динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-46, для

алифатических альдегид- и кетон-динитрофенилгидразонов нейтрального

характера при длинах волн 356, 363, 370 нм, основного характера – при 430 и

530 нм, соответственно. Каждую опытную пробу измеряли против контроля.

Содержание продуктов окисления белков представляли в ед.опт.пл/г общего

белка.

2.2.2. Определение общего белка биуретовым методом

Уровень общего белка определяли биуретовым методом с

использованием диагностических наборов фирмы «Vital Diagnostics» (страна

производитель - Россия). Принцип метода основан на том, что в результате

взаимодействия белковых молекул с ионами меди в щелочной среде

образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при

длине волны 540 нм. Опытную пробу измеряли против холостой пробы и

стандарта. Определение производили на спектрофотометре СФ-46.

2.2.3. Исследование уровня ПОЛ с помощью определения

содержания ДК, ТК и ОШ

Количество ДК, ТК и ОШ измеряли в гептан-изопропанольных

фракциях, так как в гептане экстрагируются в основном нейтральные

липиды, а в изопропаноле – фосфолипиды, таким образом, гептановая

фракция свидетельствует об активности ПОЛ в нейтральных липидах, а

изопропанольная – в фосфолипидах (Волчегорский и др., 1989).

95

При анализе к 0,1 мл сыворотки крови или гомогената ткани добавляли

8 мл гептан-изопропанольной смеси в пропорции 1:1, встряхивали в течение

15 минут и центрифугировали при 6000 оборотов в минуту 10 минут. Затем

липидный экстракт переносили в чистую пробирку и добавляли 5 мл гептан-

изопропанольной смеси в соотношении 3:7 по объёму, после чего в пробирку

добавляли 2 мл 0,01Н водного раствора соляной кислоты для разведения фаз

и удаления нелипидных примесей. После разделения фаз верхнюю

(гептановую) переносили в чистую пробирку, а к нижней добавляли 1г

прокалённого хлорида натрия для обезвоживания изопропанольного

экстракта, который переносили в чистую пробирку. Замер оптических

плотностей (Е) производили на спектрофотометре СФ-46. Каждая фаза

оценивалась против соответствующего контроля при длинах волн 220 нм

(поглощение изолированных двойных связей), 232 нм (поглощение ДК), 278

нм (поглощение ТК), 400 нм (поглощение ОШ). Содержание ДК, ТК, ОШ

оценивали по относительным величинам Е232/Е220, Е278/Е220, Е400/Е220 и

выражали в относительных единицах (Хышиктуев, Хышиктуева, Иванов,

1996).

2.2.4. Определение активности ГSТ

Анализ активности ГSТ проводили по скорости образования глутатион-

S-конъюгатов между восстановленным глутатионом и 1-хлор-2,4-

динитробензолом (Карпищенко, 2002). Водный раствор образующегося

продукта имеет максимум поглощения при 340 нм. В 10 мм кювету с

опытной пробой вносили 1,2 мл 2 мМ раствора восстановленного глутатиона

и 0,1 мл сыворотки крови. Реакцию инициировали внесением в обе кюветы

по 1,2 мл 2 мМ 1-хлор-2,4-нитробензола. Оптическую плотность опытной

пробы измеряли сразу и через 3 минуты против контроля, в который вместо

сыворотки крови вносили 0,1 мл Н2О. Активность фермента в сыворотке

крови рассчитывали по формуле: А=∆Е•868 ммоль/мин•л.

96

2.2.5. Анализ электрической активности сердца крыс

Параметры

ЭКГ

анализировались

с

помощью

ветеринарного

электрокардиографа Полиспектр-8/В. Обработку результатов ЭКГ проводили

с помощью программы Нейрософт.

Электрическую активность сердца оценивали по следующим параметрам:

частота сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин), максимальное обнаруженное

расстояние между двумя следующими друг за другом QRS-комплексами

(RRmax, мс), минимальное расстояние между двумя следующими друг за

другом QRS-комплексами (RRmin, мс), среднее расстояние между QRS-

комплексами (RRср, мс), длительность Q-волны (Q, мс), длительность R-

волны (R, мс), интервал PR (мс), длительность QRS-комплекса (QRS, мс),

интервал QT (мс), нормализованный интервал QTc, вычисляемый по

формуле Базетта (QTc, мс), электрическая ось сердца (ось QRS),

напряженность зубцов Q, R, S и T (мВ).

2.2.6. Электронно-микроскопический анализ

Для электронно-микроскопического исследования иссекали сердечную

и скелетную мышечную ткани, фиксировали ее в 2,5 % растворе глютарового

альдегида на фосфатном буфере (рН=7,4) с последующей дофикацией 1%

раствором осмиевой кислоты, обезвоживанием в спиртах возрастающей

концентрации с последующей заливкой в смесь эпона с аралдитом

(Саркисова, Перова, 1996). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Leica

UC7 и просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе

Morgagni 268D фирмы FEI. Морфометрию проводили с помощью программы

AnalySIS.

2.3. Статистическая обработка результатов

Статистическая обработка результатов проводилась согласно С. Гланцу

(1999) с использованием пакета программ Microsoft Exsel, Biostat 4.3, SPSS

Statistics Version 21. Достоверность показателей в группах оценивалась по

критериям Стьюдента и Фишера, связь между показателями оценивалась с

97

помощью критериев Пирсона и Спирмена. Соответствие опытных данных

нормальному распределению проверяли по критерию Колмогорова-

Смирнова.

98

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Альтерация сердечной и легочной ткани крыс гамма-излучением

при последующем воздействии низкоинтенсивным широкополосным

красным светом

3.1.1. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

электрическую активность сердца крыс после воздействия

ионизирующей радиацией на область сердца

Сердце до недавнего времени рассматривали как радиорезистентный

орган, основываясь главным образом на результатах гистологических

исследований.

Однако,

впоследствии,

с

помощью

электронно-

микроскопического метода были обнаружены непосредственные и

отдаленные изменения миокарда после локального облучения 5-10 Гр. При

этом основную роль играло нарушение циркуляции вследствие облитерации

капилляров (Ярмоненко, 2004). В результате лучевой терапии может

развиваться комплекс клинически значимых поражений тканей сердца –

радиационно-индуцированная болезнь сердца (Heidenreich, Kapoor, 2009),

которая является существенным фактором ухудшения качества жизни и

увеличения риска смертности (Ванюков, 2010).

Исследования проводились на беспородных белых крысах массой 180-

250 грамм, которые были разделены на 5 групп. Первую группу (контроль)

составили 17 крыс, получивших локальное облучение области сердца. Доза

облучения составила 9 Гр. Облучение проводилось на установке «Луч-1»

(энергия гамма-квантов, получаемых при распаде кобальта 60, имела два

пика: 1,17 и 1,33 МэВ). Вторую группу (опыт) составили 10 крыс, также

получивших локальную дозу облучения 9 Гр, но впоследствии проекционная

область сердца которых была облучена низкоинтенсивным красным светом в

течение 20 минут. Забор материала (миокарда) у опытной и контрольной

групп производился в день облучения ионизирующей радиацией. В третью

группу (хронический контроль) вошли 10 крыс, также получивших

99

локальное облучение на область сердца, но не подвергавшихся воздействию

широкополосного красного света. Забор материала у данной группы

производился на четвертые сутки, после развития радиационного поражения.

Четвертую группу (хронический опыт) составили 10 крыс, получивших ту же

дозу гамма-излучения, но впоследствии ежедневно, в течение четырёх дней

облучавшихся низкоинтенсивным красным светом. Время каждой

экспозиции составляло 20 минут. Интенсивность света в зоне светового

пятна была равна 5 мВт/см2. В эксперименте использовался широкополосный

свет сверх яркого светодиода с максимумом спектрального диапазона 630 нм

и шириной на полувысоте 20 нм. При прохождении через грудину

интенсивность света снижалась на 20%. Забор материала у четвертой группы

(хронический опыт) также производился на четвертые сутки. Кроме того,

нами была выделена пятая группа животных, не подвергавшихся

воздействию ни гамма-излучения, ни широкополосного красного света,

условно названная «норма».

В

каждой

группе

животных

анализировались

параметры

электрокардиограммы с помощью ветеринарного электрокардиографа

Полиспектр-8/В. Обработку результатов ЭКГ проводили с помощью

программы Нейрософт.

Для оценки функционального состояния миокарда наиболее доступным

методом является ЭКГ. При развитии радиационно-индуцированной болезни

сердца многими авторами отмечается снижение глобальной сократимости

миокарда (Тарасевич, Бегун, 2005; Botti et аl., 1986; Brosius, Waller, Roberts,

1981; Fajardo, Berthrong, Anderson, 2001;); на ЭКГ отмечается снижение

амплитуды зубцов комплекса QRS, изменения сегмента ST и стойкое

уплощение зубца Т. Однако изменения ЭКГ могут и отсутствовать, несмотря

на выраженный фиброз миокарда (Сумароков, Моисеев, 1978).Некоторые

авторы отмечают возникновение нарушений диастолической функции сердца

(Моисеев, Моисеев, 1990; Botti et аl., 1986); изменения на ЭКГ в виде

аритмий, нарушения проводимости (Феоктистов и др., 2011).

100

Электрическую активность сердца оценивали по следующим параметрам:

частота сердечных сокращений (ЧСС, уд./мин), максимальное обнаруженное

расстояние между двумя следующими друг за другом QRS-комплексами

(RRmax, мс), минимальное расстояние между двумя следующими друг за

другом QRS-комплексами (RRmin, мс), среднее расстояние между QRS-

комплексами (RRср, мс), длительность Q-волны (Q, мс), длительность R-

волны (R, мс), интервал PR (мс), длительность QRS-комплекса (QRS, мс),

интервал QT (мс), нормализованный интервал QTc, вычисляемый по

формуле Базетта (QTc, мс), электрическая ось сердца (ось QRS),

напряженность зубцов Q, R, S и T (мВ).

Анализ ЭКГ, полученных при облучении лабораторных животных

ионизирующей радиацией, показал, что статистически значимые различия

между группами наблюдались в показателях QT и QTc (p≤0,05), отражающих

сумму процессов деполяризации и последующей реполяризации миокарда

желудочков. Результаты по данным параметрам для всех групп

лабораторных животных представлены на рисунках 4 и 5.

700

***,****

*****

600

500

400

*, **

300

200

100

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 4. Показатель QT (мс) (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

101

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

1400

***, ****

1200

1000

*****

800

600

*, **

400

200

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 5. Показатель QTс (мс) (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

Исходя из рисунков 4 и 5, можно сделать вывод о постепенном

увеличении QT и QTc интервалов после облучения миокарда гамма-

излучением, которое достигает максимума на четвёртый день после

облучения (хронический контроль), что говорит об увеличении механической

систолы. Этот эффект обуславливается ишемией миокарда, вызванной

воздействием ионизирующей радиации. При сравнении нормы с опытными

группами статистически значимых различий выявлено не было, что

свидетельствует о стабилизации работы сердца при воздействии на очаг

облучения низкоинтенсивным красным светом.

Статистически значимые различия между группами наблюдались также

при сравнении напряжения зубцов R и Т (мВ). Зубец R отражает

102

возбуждение верхушки сердца и прилегающих к ней областей, а нарушение

реполяризации сопровождается изменениями зубца T. В отличие от

деполяризации, реполяризация является энергоемким процессом. Для

синтеза АТФ необходим кислород, поэтому в ходе развития ишемии

миокарда в первую очередь начинает страдать процесс реполяризации, и

происходит изменение зубца Т. Нарушение реполяризации желудочков ведет

к нарушениям метаболизма миокарда, острой его дистрофии и к

наступлению кислородной недостаточности. Отклонение зубца Т от нормы

обычно сопровождается удлинением интервала QT. Данные, касающиеся

напряжения зубцов R и Т, представлены на рисунках 6 и 7.

0,9

*****

0,8

0,7

***, ****

0,6

*, **

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 6. Напряжение зубца R (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

103

0,18

0,16

***

0,14

0,12

0,1

*

0,08

**

0,06

0,04

0,02

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 7. Напряжение зубца Т (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

хроническим контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом.

Анализируя полученные результаты, можно сделать вывод о том, что на

четвертые сутки после облучения области сердца гамма-излучением

наблюдается достоверное увеличение амплитуды зубцов R и Т. Наблюдаемое

снижение напряжения зубцов Т в контрольной серии обусловлено

появлением отрицательных зубцов, свидетельствующих о развитии ишемии

миокарда уже на первые сутки после воздействия ионизирующим

излучением. Значительное увеличение напряжения Т-зубцов в группе

«хронический контроль» говорит о нарастании ишемии миокарда, которая

развивается в течение четырёх суток после воздействия ионизирующим

излучением. Экспонирование животных опытной группы и группы

хронического опыта широкополосным красным светом привело к

статистически значимому восстановлению параметров электрической

активности сердца. Таким образом, спровоцированная гамма-излучением

ишемия миокарда в опытных группах носила обратимый характер.

104

По нашему мнению, в основе наблюдаемых эффектов восстановления

проводимости и сократимости миокарда лежит явление повышения

антиоксидантной активности кардиомиоцитов. В свою очередь, это явление

обусловлено нормализующим действием световой энергии красного спектра,

результатом которого является восстановление параметров электрической

активности сердца.

3.1.2. Эффекты воздействия широкополосного красного света на

спонтанную окислительную модификацию белков в сердечной, легочной

тканях и сыворотке крови крыс после воздействия ионизирующей

радиацией на область сердца

На данный момент, исходя из клинических и экспериментальных

данных, можно полагать, что определение окисленно-модифицированных

белков является универсальным методам в диагностике многих заболеваний.

В настоящее время известно, что при развитии многих патологических

состояний в первую очередь окислительной деструкции подвергаются белки,

а не липиды и ДНК, причем продукты окисления белков являются более

стабильными (Agarwal, Sohal, 1995; Forster et al., 1996; Friguet et al., 2000;

Goto et al., 2001; Halliwell, 1992; Hensley, Floyd, 2002; Mecocci et al., 1999;

Musci et al., 1993; Smith et al., 1992; Stadtman, 2001; Stadtman, Berlett, 1997;

Stadtman, Berlett, 1998; Stadtman et al., 1993; Stadtman et al., 1992; Yan, Levine,

Sohal, 1997), поэтому их окислительная модификация рассматривается как

один ранних и надежных маркеров окислительного стресса (Caraceni et al.,

1997; Halliwell, 1992).

Свободнорадикальное окисление белков – процесс, протекающий в

норме, а также приводящий к различным патологическим изменениям в

организме. Этот процесс цепной, в результате образуются карбонильные

группировки, которые являются маркером окислительной деструкции белков.

105

Классический реагент для обнаружения карбонильных групп – 2,4-ДНФГ

(Aust et al., 1993):

Белок-С=О + Н2N-NH-ДНФ → Белок-С=N- NH-ДНФ + Н2О

В результате образуются 2,4-динитрофенилгидразоны нейтрального и

основного характера. По данным автора метода, при 356 и 363 нм

регистрируются

алифатические

альдегид-динитрофенилгидразоны

нейтрального характера, при 370 нм – алифатические кетон-

динитрофенилгидразоны нейтрального характера, при 430 и 530 –

алифатические альдегид- и кетон-динитрофенилгидразоны основного

характера. (Дубинина и др., 1995).

Продуктами

нейтрального

характера

являются

производные

нейтральных аминокислот, основного характера – производные основных

аминокислот (серин, треонин, тирозин). Меньшим количеством основных

аминокислот объясняется низкое содержание продуктов основного характера

в исследуемых объектах (Тургунова и др., 2006).

Результаты проведенных исследований продуктов спонтанной ОМБ в

сердечной ткани крыс после облучения ионизирующей радиацией выявили

различия в содержании данных продуктов в тканях животных пяти

исследуемых групп. Так, в сердечной ткани животных контрольных групп

наблюдалось постепенное увеличение содержания продуктов спонтанной

ОМБ. Для части показателей максимальные значения были в группе

«хронический контроль», забор материала которой проводился на четвертые

сутки после облучения ионизирующей радиацией, но для большинства из

них максимальные значения были в группе «контроль», что говорит об

интенсификации процессов окисления в течении нескольких часов после

облучения гамма-излучением. Исследование данных параметров в опытных

группах показало положительную динамику в содержании продуктов

спонтанной ОМБ после воздействия широкополосным красным светом на

зону облучения гамма-излучением. В группе «хронический опыт»

содержание продуктов окисления приближалось к нормальным, по всем

106

показателям статистически значимые различия между группами «норма» и

«хронический опыт» отсутствовали. Результаты исследования продуктов

спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс представлены на рисунках 8-12.

0,4

*****

0,35

0,3

0,25

***, ****

0,2

0,15

0,1

*, **

0,05

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 8. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс при

длине волны 356 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

107

0,6

***, ****

0,5

*****

0,4

0,3

0,2

*, **

0,1

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 9. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс при

длине волны 363 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

0,9

***, ****

0,8

)0,7

спонтанной

0,6

белка/г0,5

*****

.пл

.оп0,4

родуктов п (ед0,3

ОМБ0,2

*, **

0,1

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

108

Рис. 10. Содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс при

длине волны 370 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

0,25

***, ****

)

0,2

спонтанной

белка

*****

0,15

.пл

родуктов

.оп

п

0,1

(ед

*, **

ОМБ0,05

содержание

0

норма

контроль хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 11. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

основного характера при спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс при длине

волны 430 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

109

0,08

****

0,07

)0,06

спонтанной

белка0,05

.пл0,04

родуктов

.оп

***

п

0,03

(ед

0,02

ОМБ

*, **

0,01

содержание

0

норма

контроль хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 12. Содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов

основного характера при спонтанной ОМБ в сердечной ткани крыс при длине

волны 530 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом.

Из представленных рисунков видно, что статистически значимые

различия между «нормой» и «хроническим опытом» отсутствуют, что

свидетельствует о коррекции нарушений, вызванных ионизирующей

радиацией, с помощью широкополосного красного света (рис. 13).

110

ОМБ

0,5

*

*

*

)0,4

0,3

/г белка

уктов спонтанной

*

д

.пл

0,2

*

о

.оп

(ед

0,1

ание пр

хронический контроль

жр

0

е

хронический опыт

сод

356

363

норма

370

430

530

длина волны (нм)

Рис. 13. Содержание продуктов спонтанной ОМБ в сердечной ткани

крыс групп «хронический опыт» и «хронический контроль» в сравнении с

«нормой» (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

хроническим контролем.

Таким образом, можно говорить о достоверном снижении накопления

конечных продуктов ОМБ в сердечной ткани животных из группы

«хронический опыт», вызванном воздействием широкополосного красного

света. Исследование данных продуктов в группе «хронический контроль»

показало значительное повышение спонтанной ОМБ (указывающей на

количество модифицированных аминокислот) при длинах волн 356 нм в 6,87

раза, 363 нм – 7,20 раза, 370 нм – 8,29 раза, а при 430 и 530 нм в 5,25 и 6,31

раза, соответственно.

Кроме этого, в процессе облучения области сердца и регионарных

лимфатических узлов высока вероятность развития повреждений легочной

ткани (Важенин, Куницкая, 2006; Збицкая, Збицкая, 2002; Кепплер,

Климанов, 2001; Харченко, Кузьмин, 1994; Theuws et al., 1999; Van Leeuwen

et al., 2002; Yamada et al., 1998).

При исследовании содержания продуктов спонтанной ОМБ в легочной

ткани крыс, были получены сходные результаты. Наибольшие отличия от

111

«нормы» имела группа «хронический контроль», не получившая воздействия

широкополосного красного света, в которой содержание продуктов

спонтанной ОМБ максимально, что связано с истощением антиоксидантной

системы животных на четвертые сутки после облучения ионизирующей

радиацией. Обращает на себя внимание отсутствие статистически значимых

различий между группами «норма» и «хронический опыт» по большинству

показателей, показывающее нормализацию процессов окисления белков в

легочной ткани. Результаты исследования продуктов спонтанной ОМБ в

легочной ткани крыс представлены на рисунках 14-18.

1,6

****

1,4

)1,2

спонтанной

белка

1

.пл0,8

родуктов

.оп

***

п

0,6

(ед

*, **, *****

0,4

ОМБ

0,2

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 14. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс при

длине волны 356 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

опытом.

112

1,6

****

1,4

)1,2

спонтанной

белка

1

.пл0,8

родуктов

.оп

***

п

0,6

(ед

*, **, *****

0,4

ОМБ

0,2

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 15. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс при

длине волны 363 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

опытом.

2,5

****

)

2

спонтанной

белка/г1,5

.пл

родуктов

.оп

п

1

(ед

***

*, **

ОМБ0,5

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

113

Рис. 16. Содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при индуцированной ОМБ в легочной ткани крыс

при длине волны 370 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом.

1

****

0,9

)0,8

0,7

спонтанной

белка/г0,6

.пл0,5

родуктов

.оп

п

0,4

***

(ед0,3

ОМБ0,2

*, **

0,1

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 17. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

основного характера при спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс при длине

волны 430 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом.

114

0,14

***, ****

*****

0,12

)

0,1

спонтанной

белка/г0,08

.пл

родуктов

.оп0,06

п

(ед

0,04

ОМБ

*, **

0,02

содержание

0

норма

контроль хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 18. Содержание алифатических кетон-динитрофенилгидразонов

основного характера при спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс при длине

волны 530 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

***** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем

и хроническим опытом.

Исследование продуктов спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс не

выявило статистически значимых различий между группами «контроль» и

«опыт» (кроме продуктов, определяемых на длине волны 530 нм). Хотя в

большинстве случаев процессы ОМБ шли более интенсивно в группе

«контроль», не подвергавшейся воздействию низкоинтенсивного красного

света после облучения ионизирующей радиацией. Данный факт говорит о

недостаточности одного сеанса воздействия широкополосным красным

светом в течение трех часов после облучения гамма-излучением. С другой

стороны, в группе «хронический контроль», забор легочной ткани которой

проводился на четвертые сутки, наблюдался рост уровня спонтанной ОМБ

до максимальных значений по сравнению с «нормой» (при длинах волн 356 и

115

363 нм в среднем в 4,95 раза, 370 нм – 5,80 раза, а при 430 и 530 нм в 6,81 и

5,88 раза, соответственно) (рис. 19).

Б

*

МО

2

*

*

анной

)1,5

*

ов спонт

1

/г белка

**

укт

.пл

0,5

*

род

.оп

п

(ед

хронический контроль

0

хронический опыт

ржание е

356

363

норма

370

сод

430

530

длина волны (нм)

Рис. 19. Содержание продуктов спонтанной ОМБ в легочной ткани крыс

групп «хронический опыт» и «хронический контроль» в сравнении с

«нормой» (р ≤ 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

хроническим контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

опытом.

В то же время в группе «хронический опыт» наблюдалось уменьшение

накопления конечных продуктов спонтанной ОМБ до значений, близких к

нормальным (кроме алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера, определяющихся при длинах волн 356 и 363 нм).

Исследование спонтанной ОМБ в сыворотке крови лабораторных

животных также показало наличие статистически значимых различий между

группами (рис. 20-24).

116

2,5

)

2

спонтанной

белка/г1,5

.пл

родуктов

.оп

п

1

(ед

ОМБ0,5

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт

Рис. 20. Содержание алифатических альдегид-динитрофенилгидразонов

нейтрального характера при спонтанной ОМБ в сыворотке крови крыс при

длине волны 356 нм (р 0,05).

Примечание: * - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и

контролем;

** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между нормой и хроническим

контролем;

*** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между контролем и хроническим

опытом;

**** - статистически значимые различия (р ≤ 0,05) между хроническим контролем и

хроническим опытом.

2,5

)

2

спонтанной

белка/г1,5

.пл

родуктов

.оп

п

1

(ед

ОМБ0,5

содержание

0

норма

контроль

хронический

опыт

хронический

контроль

опыт