Исследование эстеразного профиля ряда О-фосфорилированных этилтрифторлактатов



ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………….7

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР………………………………………….14

  1. Ацетилхолинэстераза……………………………………………………...14

  1. Основная физиологическая функция и локализация АХЭ.……….14

  1. Структура и каталитический механизм действия АХЭ..………….16

  1. Неклассические функции АХЭ…………………………………......22

  1. Заболевания, связанные с АХЭ…………………………………......23

  1. Механизм ингибирования АХЭ……………………………………..25

  1. Токсикологические и фармакологические аспекты

ингибирования АХЭ.……………………………………………………….29

  1. Бутитилхолинэстераза………………………………………………..........35

  1. Физиологическая функция и локализация БХЭ…………………....35

  1. Генетический полиморфизм БХЭ…………………………………...36

  1. Структура БХЭ………………………………………………………..38

  1. Биологическая роль БХЭ……………………………………………..41

1.2.4.1. Роль БХЭ в метаболизме лекарственных

препаратов.…………………………………………………………….42

  1. Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС………………………………………….43

  1. Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера………...44

3

  1. Нейропатичная эстераза…………………………………………………...47

  1. Физиологическая роль и локализация НТЭ………………………..47

  1. Структура НТЭ………………………………………………………50

1.3.3. Синдром отставленной нейротокичности, вызываемой

ФОС (ОНТФОС)……………………………………………………………53

  1. Роль НТЭ в механизме инициирования ОНТФОС………………..57

  1. Ингибирование и «старение» НТЭ…………………….........57

  1. Оценка нейропатичного потенциала

фосфорорганических соединений……………………………………62

1.3.4.3. НТЭ как биомаркер воздействия нейропатичных ФОС………………………………………………….63

  1. Карбоксилэстераза……………………………………………………........66

  1. Физиологическая функция и локализация КЭ……………………..66

  1. Изоформы КЭ

млекопитающих…………………………………......66

  1. Структура КЭ………………………………………………………....71

  1. Биологическая роль КЭ……………………………………………...76

  1. Роль КЭ в метаболизме лекарственных препаратов..……...76

  1. Роль КЭ в метаболизме липидов……………………………..77

  1. Взаимодействие с ФОС: роль КЭ как биоскэвенджера

  1. Параоксоназа ………………………………………………………………80

4

  1. Локализация и субстратная специфичность PON1………..............80

  1. Структура PON1…..............................................................................82

  1. Физиологическая функция PON1……………………………………83

  1. Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств.……………….84

  1. PON1 и детоксикация ФОС…………………………………………84

  1. Генетический полиморфизм PON1…………………………………86

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………………..89

  1. Материалы………………………………………………………………….89

  1. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ,

КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями ...................………………90

  1. QSAR анализ эстеразного профиля соединений………………………...95

  1. Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)……………………..96

  1. Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови……........99

  1. Определение величин IC50 для ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ

и НТЭ исследуемыми соединениями в препаратах мозга и крови ………..105

  1. Эксперименты на животных…………………………………………......106

  1. Статистическая обработка результатов…………………………………107

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………108

3.1. Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз………………………..108

5

3.1.1. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ О-фосфорилированными этилтрифторлактатами……………………….109

  1. Анализ эстеразного профиля О-фосфорилированных этилтрифторлактатов………………………………………………………116

  1. Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном.…………………………………………………………………..128

  1. Оценка эстеразного профиля О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (diEt-PFP, diBu-PFP) и маркерного

соединенияО,О-дипропил-О-дихлорвинилфосфата (diPr-DClVP)…….132

  1. Исследование активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1

  1. Разработка методов пробоподготовки и оптимизация

методик определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1

в цельной крови…………………………………………………………...135

3.2.2. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в плазме

крови человека и крысы в стандартных условиях……………………...147

3.2.3. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1

в цельной крови человека, мыши и крысы……………………………...148

3.3. Мыши как модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала фосфорорганических оединений………………………………..152

3.3.1. Сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур к действию ФОС с различным

эстеразным профилем в экспериментахin vitro………………………...154

3.3.2. Сравнительное исследование ингибирования НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур фосфорорганическими соединениями

6

в экспериментах на целом животном……………………………………159

3.3.3. Использование НТЭ крови мышей в качестве биохимического маркера отравления нейропатичными ФОС…………163

3.4. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови

мышейin vitro…………………………………………………………………169

3.4.1. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP,

diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышейin vitro…..169

3.4.2. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP,

diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышейin vitro…..173

3.5. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма…………179

3.5.1. Ингибирование эстераз мозга мышей при внутрибрюшинном введении ФОС………………………………………179

3.5.2. Ингибирование эстераз крови мышей привнутрибрюшинном введении ФОС………………………………………183

3.5.2.1. Вклад эстераз-скэвенджеров в формирование токсических эффектов………………………………………………..187

3.5.2.2. Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей……...189

ВЫВОДЫ…………………………………………………………………………194

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ……………………………………………………..196

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………….......197

7

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования.Органические производныепятивалентного фосфора (фосфорорганические соединения, ФОС) широко применяются в агрохимической практике и ветеринарии (инсектициды, акарициды, противопаразитные агенты), в промышленности (пластификаторы, компоненты смазочных материалов, антипирены), в качестве лекарственных средств для лечения шистосомоза (метрифонат), глаукомы (экотиофат), рака (циклофосфамид), остеопороза (некоторые бисфосфонаты). Некоторые высокотоксичные ФОС являются химическими боевыми отравляющими веществами, огромные запасы которых, накопленные в мире (Зарин, VX), как и проблемы, связанные с их транспортировкой, уничтожением и переработкой, представляют в настоящее время серьезную экологическую опасность.

Ряд ФОС помимо острого токсического действия, обусловленного ингибированием ацетилхолинэстеразы (АХЭ) нервных синапсов, может индуцировать синдром «отставленной нейротоксичности, вызываемой фосфорорганическими соединениями» (ОНТФОС). Это дистальные нейропатии, проявляющиеся после 2-3 недельного латентного периода и характеризующиеся дегенерацией длинных аксонов периферической и центральной нервной системы. Высокая чувствительность человека к действию нейропатичных ФОС, наличие длительного скрытого периода между отравлением и клиническими проявлениями ОНТФОС, отсутствие специфических средств лечения и высокий уровень инвалидизации пострадавших, делают чрезвычайно важной проблему оценки риска отставленного нейротоксического действия ФОС и ранней диагностики этого заболевания.

В связи с широким применением ФОС и необходимостью создания новых соединений и материалов, которые были бы безопасны для человека и теплокровных, весьма актуальной является задача выяснения механизмов формирования токсических эффектов данного класса соединений, а также

8

разработка новых биомаркеров воздействия ФОС на человека и их количественная оценка.

Фармакологическое применение антихолинэстеразных соединений и потребность в новых эффективных препаратах, не обладающих опасными побочными эффектами, обусловливают необходимость разработки методологии прогнозирования потенциальных терапевтических и токсических эффектов соединений на этапе их синтеза и исследованийin vitro.

Для характеристики эффективности взаимодействия антихолин-эстеразных соединений с эстеразами-мишенямиin vitro в нашей лаборатории предложена концепция «эстеразного профиля» – набора кинетических констант, описывающих ингибиторную активность соединения в отношении эстераз различной функциональной значимости: ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7, АХЭ, острая токсичность, улучшение когнитивных функций); нейротоксичной эстеразы (КФ 3.1.1.5, НТЭ, отставленная нейротоксичность, ОНТФОС), бутирилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.8, БХЭ, стехиометрический скэвенджер, улучшение когнитивных функций, модуляция метаболизма лекарств), карбоксилэстеразы (КФ 3.1.1.1, КЭ, стехиометрический скэвенджер, модуляция метаболизма лекарств). Анализ эстеразного профиля позволяет получить более полную картину биологической активности соединения и оценить баланс между его терапевтическим свойствами и нейротоксичным потенциалом.

Анализ эстеразного профиля позволяет также оценить перекрестную специфичность антихолинэстеразных соединений и возможность возникновения нежелательного лекарственного взаимодействия при применении ингибиторов рассматриваемых эстераз в качестве лекарственный препаратов.

Токсические и терапевтические эффекты, являющиеся результатом ингибирования фосфорорганическими соединениями указанных 4-х сериновых эстераз, представлены ниже на Схеме, где курсивом выделены эффекты, определяющие токсическое действие ФОС.

9

Список мишеней-эстераз, безусловно, может быть расширен включением в него ряда других белков, ковалентно связывающих ФОС, таких как ацилпептидгидролаза, гидролаза амидов жирных кислот (fatty acid amide hydrolase, FAAH, КФ 3.5.1.99), арилформамидаза (КФ 3.5.1.9), сывороточный альбумин [1-3]. В данной работе мы ограничимся рассмотрением взаимодействия ФОС с четырьмя вышеперечисленными сериновыми гидролазами.

При попадании в организм ФОС взаимодействуют с АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови, а также с параоксоназой (КФ 3.1.8.1, PON1), которая может гидролизовать и детоксицировать фосфорорганические соединения и действовать как каталитический скэвенджер. Совокупность активностей указанных ферментов в крови входит в понятие «эстеразный статус» организма, который в значительной степени определяет видовую и индивидуальную чувствительность к антихолинэстеразным соединениям.

В токсикологических и фармакологических исследованиях комплексная оценка химических рисков и потенциальных терапевтических свойств соединений основывается на предположении (экстраполяции), что эффект, наблюдаемый на лабораторных животных, будет наблюдаться и у человека.

10

Этические нормы, концепции защиты животных, а также новые методологии создания лекарственных средств с заданными свойствами ставят задачу постепенной замены тестов на животных для скрининговых исследований и оценки безопасности химических средств и продуктов. Актуальным становится поик альтернативных моделей (ферментных, клеточных, компьютерных и т.д.). Ценность таких моделей заключается не только или не столько в их способности заменить животных, сколько в получении максимально полной информации о потенциальных фармакологических и токсических свойствах соединений до проведения исследований на животных.

Цель и задачи исследования.Целью настоящей работы являлосьисследование эстеразного профиля ряда О-фосфорилированных этилтрифторлактатов и некоторых представителей родственных соединений – О-фосфорилированных гексафторизопропанолов, и проверка в экспериментах на тканевом уровне (кровь, мозг) и на уровне целого организма прогнозов и выводов, сделанных на основании анализа эстеразного профиля соединений.

Для достижения цели работы были поставлены следующиезадачи:

– оценка и анализ эстеразного профиля гомологичных O-фосфорилированных этилтрифторлактатов и выбор соединений для исследования на тканях и на целом организме;

– разработка методов определения АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови и сравнительное исследование «эстеразного статуса» человека и грызунов путем определения в крови активностей указанных ферментов;

– исследование НТЭ мозга и крови мышей как биомаркера воздействия нейропатичных ФОС;

– исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах мозга и крови мышейin vitro;

– исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мозга и крови мышей на уровне целого организма при внутрибрюшинном

11

(в/бр) введении.

Научная новизна работы.На примере фосфорорганических соединенийвпервые показано, что эстеразный профиль ингибиторов холинэстераз в значительной степени определяет их эффекты на тканевом уровне и на уровне целого организма.

Впервые подробно охарактеризован «эстеразный статус» человека и лабораторных животных (мыши и крысы).

Установлено, что НТЭ мозга и крови мышей являются биохимическими маркерами отравления нейропатичными ФОС. Разработана модель на мышах

для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС.

Найденновыйэффективныйиселективныйингибитор

карбоксилэстеразы плазмы крови мышей с низкой острой токсичностью.

Практическаязначимостьработы.Проведенноеисследование

показывает,

что

методология

анализа

эстеразного

профиля

антихолинэстеразных

соединений,

учитывающая

конкурирующее

взаимодействие соединения с несколькими мишенями, позволяет прогнозировать терапевтические и токсические эффекты соединения, и может быть использована в скрининговых исследованиях при создании новых эффективных и безопасных лекарственных средств.

Показана возможность использования стандартных лабораторных животных (мышей) для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС вместо дорогостоящих исследований, традиционно проводимых на курах.

Найденный в ходе работы эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы крови мышей, обладающий низкой острой токсичностью, может использоваться для стабилизации потенциальных фармакологических агентов, содержащих сложноэфирные или амидные группы, при проведении доклинических исследований на грызунах.

Полученные в настоящей работе данные по «эстеразному статусу» человека и грызунов важны при проведении исследований в области медицины и токсикологии, а также для более корректной экстраполяции

12

экспериментальных результатов с животных на человека и в качестве базовых активностей при биомониторинге.

Личный вклад авторасостоял в разработке условий и методовисследования, в планировании экспериментов, в подготовке образцов тканей животных и проведении экспериментальной работы, в обработке, обобщении и интерпретации полученных данных, анализе литературных источников. Автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов и их апробации на российских и международных научных форумах.

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю к.х.н., зав. лабораторией молекулярной токсикологии Г.Ф. Махаевой за помощь в постановке задачи, за ценные замечания и поддержку в ходе выполнения и написания данной работы. Автор выражает искреннюю благодарность своим соавторам: н.с. лаборатории молекулярной токсикологии ИФАВ РАН О.Г. Серебряковой за помощь в проведении кинетических исследований и в работе с животными, м.н.с лаборатории молекулярной токсикологии Т.Г. Галенко за помощь в проведении токсикологических экспериментов, с.н.с., к.х.н. Химфака МГУ Л.В. Сиголаеву за помощь в проведении электрохимических измерений. Автор благодарит зав. лаб. синтеза ФАВ к.х.н. Соколова В.Б. и к.х.н., вед. н.с. А.Ю. Аксиненко за предоставленные для исследований фосфорорганические соединения.

Апробацияработы.Результатыработыбылипредставленынаследующихконференциях: 11th SAC Seminar “New Trends In Chemical Toxicology”, 22-25 September 2008, Moscow; Society of Toxicology, Annual Meeting, 15-19 March 2009, Baltimore, USA; 12th Medical Chemical Defense Conference, 21-24 April 2009, Munich, Germany; 10th International Meeting on Cholinesterases, 20-25 September 2009, Sibenik, Croatia; VIIВсероссийскаяконференцияХимияимедицина «Орхимед-2009», 1-5июля 2009,Уфа,Россия; 13th International CWD Conference, 24-27 May 2010, Prague, Czech Republic; VIII

Всероссийская конференция с международным участием “Химия и медицина”,

13

6-8апреля 2010,УФА,Россия; 14th International CWD Conference, 23-26 May 2011, Interlaken, Switzerland; XIX Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, 25-30 September 2011, Volgograd, Russia; 15th International CWD Conference, 21-25 May 2012, Glasgow, UK; 11th International Meeting on Cholinesterases, 4-9 June 2012, Kazan, Russia; 9-яВсероссийскаяконференции

"Химияфтора",посвященная 100-летиюсоднярожденияакадемикаА.В.Фокина, 22-26октября 2012,Москва;ПерваяРоссийскаяконференцияпомедицинскойхимии (MedChem Russia-2013), 8-12сентября 2013,Москва; 4th National Congress of Clinical Toxicology with International Participation and Annual Meeting of Bulgarian Toxicological Society, 7-8 November 2013, Sofia, Bulgaria.

Публикации.По материалам исследований опубликовано38работ,в томчисле 9 статей в международных и отечественных журналах, 3 статьи в материалах конференций, 7 глав в книгах, 18 тезисов докладов международных и российских конференций, получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы.Диссертация изложена на255страницах исостоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов в 5 главах, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 514 ссылок. Работа содержит 58 рисунков и 30 таблиц.

14

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Характерной особенностью фосфорорганических соединений (ФОС) является их ковалентное взаимодействие с серином активного центра сериновых гидролаз, приводящее к необратимому ингибированию этих ферментов. При этом ацетилхолинэстераза (АХЭ) и нейротоксичная эстераза (НТЭ) являются «первичными» биомишенями, взаимодействие с которыми обусловливает острую холинэргическую токсичность и отставленную нейротоксичность (ОНТФОС), соответственно. Неспецифические эстеразы бутирилхолинэстераза (БХЭ) и карбоксилэстераза (КЭ) являются «вторичными» мишенями, которые действуют как стехиометрические скэвенджеры, снижающие концентрацию активного ФОС. Локализованная в плазме кальций-зависимая гидролаза - параоксоназа (PON1), играет центральную роль в гидролизе и детоксикации многих ФОС, действуя как каталитический скэвенджер. БХЭ, КЭ и PON1 участвуют также в детоксикации ксенобиотиков и метаболизме фармпрепаратов. Физиологическая роль и биологические функции этих ферментов подробно рассматриваются в данной главе. Структура и механизм действия ингибиторов эстераз, возможность их применения в качестве терапевтических агентов также обсуждаются в данном разделе.

  1. Ацетилхолинэстераза

  1. Основная физиологическая функция и локализация АХЭ

Ацетилхолинэстераза (АХЭ, КФ 3.1.1.7) является одним из ключевых ферментов, регулирующих работу нервной системы. Это ключевой компонент холинэргических синапсов центральной нервной системы и нервно-мышечных синапсов. [4, 5 6]. Основная физиологическая функция АХЭ – гидролиз нейротрансмиттера ацетилхолина (АХ) до холина и уксусной кислоты и, как следствие, прекращение передачи нервного импульса [7, 8]. АХЭ считается одним из самых быстрых из известных ферментов [ 9, 10]. Этот фермент имеет

15

высокое число оборотов –kcat/KM=1.6×108M-1с-1 [11], что гарантирует быстрое удаление ацетилхолина и обеспечивает готовность синапса к новому циклу передачи возбуждения. Продукты гидролиза, холин и уксусная кислота, активно захватываются пресинаптической частью синапса и используются для повторного синтеза ацетилхолина.

Реакция гидролиза ацетилхолина в присутствии АХЭ приведена на Рисунке 1.1.-1.

O

H2O

O

N

ACHE

N

O

OH

HO

Рис. 1.1. -1.Реакция гидролиза ацетилхолина в присутствии АХЭ.

АХЭ обладает довольно узкой субстратной специфичностью, помимо ацетилхолина она способна гидролизовать некоторые другие эфиры холина: ацетилтиохолин, пропионилхолин, пропионилтиохолин [12].

Помимо центральной нервной системы АХЭ локализована в симпатических и парасимпатических ганглиях, моторных окончаниях двигательных нейронов, потовых железах, в лимфатической системе и эмбриональных тканях, сердце, легких, кишечнике, селезенке и эритроцитах. [13]. АХЭ экспрессируется во всех эукариотах, включая растения [14, 15].

Генетический полиморфизм АХЭ

Активность АХЭ является жизненно важной для нейротрансмиссии. В связи с этим предполагалось, что генетические варианты АХЭ будут несовместимыми с жизнью, и поэтому не присутствуют в организме здорового человека. Однако, были описаны четыре примера генетического полиморфизма АХЭ, и два из них имели клинические проявления. Первый из клинически значимых полиморфизмов расположен в дистальном промотере гена АХЭ. Его клинические проявления связаны с высокой чувствительностью этой изоформы АХЭ к антихолинэстеразным соединениям [16, 17] и, возможно, коррелируют с

16

проявлениями синдрома войны в Персидском заливе. Были найдены и другие мутации в кДНК АХЭ, которые подробно охарактеризованы в работе [18], и, как показано, затрагивают нефункциональные области фермента.

АХЭ является эритроцитарным антигеном человека, т.е. экспрессируется на поверхности эритроцитов и определяет группу крови YT [19]. При этом существуют два варианта: нативный YT1 (90% Американской и Европейской популяции) [20] и его полиморфная модификация YT2 (всего 10%), имеющая единичную аминокислотную замену His322Asn. [19, 21].

Было показано, что данная мутация не оказывает никакого влияния ни на каталитические, ни на физические свойства АХЭ, поскольку эта аминокислота находится на периферии белка, не играет существенной роли в его конформационной стабильности и достаточно удалена от активного сайта [21, 22]. В работе [23] показано, что мыши, несущие один дефицитный аллель АХЭ, имеют около 50% нормальной активности АХЭ в головном мозге, мышцах и плазме. Эти (+/АХЭ) мыши не отличаются от мышей дикого типа по здоровью, фертильности, весу и температуре тела, но проявляют повышенную чувствительность к ФОС [24, 25]. Данные исследования подтверждает мнение, что люди с одним дефицитным аллелем АХЭ здоровы, но будут проявлять повышенную восприимчивость к токсичным ФОС.

1.1.2. Структура и каталитический механизм действия АХЭ

Ацетилхолинэстераза -гликопротеин,в котором углеводная часть молекулы составляет около 8% по массе. По механизму действия АХЭ является сериновой гидролазой, структурно она принадлежит к классу α/β-протеинов.

Структура АХЭ

Единственный ген АХЭ человека картирован на 7 хромосоме в локусе 7q22 [26] и состоит из шести экзонов. В результате альтернативного сплайсинга на C-концевом участке получаются три различных полипептида АХЭ, образующих набор изоформ с идентичными каталитическими свойствами.

17

Различия в структуре сказываются на распределении изоформ в тканях и образовании четвертичной структуры. [27, 28]. Образуются следующие формы:

в мозге, мышцах и большинстве тканей).

Первичную структуру фермента образует уникальная последовательность из 537 аминокислотных остатков. Мономер АХЭ представляет собой эллипсоидную молекулу размером 45х60х65 Å и имеет молекулярную массу порядка 60 кДа. Третичная структура АХЭ представляет собой 12 смешанных β-листов, окруженных 14 α-спиралями(Рис. 1.1.-2).

Кристаллографическая структура АХЭ установлена в 1991 [29].

Рис. 1.1. - 2.Структура ацетилхолинэстеразы(по кристаллографическимданным Рrotein Data Bank (PDB), код 1F8U,www.rcsb.org).

На Рисунке 1.1.-3 схематично представлено строение активного центра АХЭ человека, мыши иTorpedo californica. [6]. Порядковые номера

18

гомологичных аминокислотных остатков для АХЭ различных организмов не совпадают. Исторически наиболее распространенной в литературе является нумерация аминокислотных остатков АХЭTorpedo californica. Показано, что кристаллическая структура активного центра АХЭ мыши фактически идентична АХЭ человека [6, 30]. Поскольку наша работа в целом ориентирована на роль АХЭ в вопросах здоровья человека, мы используем нумерацию аминокислотных остатков АХЭ человека (hАХЭ) [6].

Активный сайт фермента находится на дне каталитической щели на глубине порядка 20 Å внутри белка (Рис. 1.1.-3). Канал каталитической щели выстилают 14 ароматических аминокислотных остатка, образующих ароматический кластер, который участвует в дополнительной фиксации субстрата путем взаимодействия с его гидрофобной областью и в его продвижении к каталитическому центру фермента [31].

Канал каталитической щели

Рис. 1.1. - 3.Наложение3Dструктур активного центра АХЭ человека,мышии Torpedo californica . Остатки, которые показывают самые большие отклонения, окрашены красным для человека, синим для мыши и желтым для Torpedo californica. На первом месте указана нумерация аминокислотных остатков АХЭ человека и мыши, в скобках указана нумерация для Torpedo californica. Torpedo californica имеет одну замену: Tyr337 (в случае человека и мыши) заменен на Phe330[6 ] .

19

В активном центре АХЭ выделяют «эфирную» (эстеразную) и «анионную» области, которые образованы тремя основными группами аминокислотных остатков (Рис. 1.1.-3 и 1.1.-4) - этокаталитическая триада

(Ser203, His447, Glu334),оксианионный центр (Gly121, Gly122, Ala204) и α-анионный сайт(Trp86, Glu202, Tyr337, Gly448).Также выделяют ацильный кармангидрофобную область внутри каталитической щели(Trp236, Phe295,Phe297, Phe338). Здесь ацетильная группа субстрата взаимодействует с Trp236, расположенным примерно в середине каталитической щели (Рис. 1.1.-3), с образованием катион-π связи. Небольшой ацилсвязывающий карман АХЭ идеально подходит для АХ, так что его гидролиз осуществляется максимально эффективно, лимитирующим фактором является диффузия субстрата[32].

Рис. 1.1. - 4.Ключевые аминокислоты активного центраацетилхолинэстеразы.[33].

Ролькаталитической триады заключается в непосредственном участии в гидролизе ацетилхолина в активном центре белка. Каталитическая триада АХЭ типична для сериновых протеаз (серин–гистидин–кислотный остаток), однако имеется и характерное отличие: в качестве кислотного остатка выступает Glu вместо более распространенного в случае сериновых протеаз Asp, боковая цепь которого короче на одно –CH2– звено, чем у Glu. Серин и

20

гистидин принимают участие в реакции в качестве нуклеофильной атакующей группы и элемента кислотно-основного катализа, соответственно (Рис. 1.1.-4) [33].

Рольоксианионного центра и α-анионного сайта в процессе катализа сводится к фиксации субстрата в активном центре фермента посредством взаимодействия с карбонильным кислородом и четвертичной триметиламмониевой группой субстрата соответственно, что вносит вклад в стабилизацию интермедиатов и переходных состояний. Пептидные группы остатков Gly121, Gly122, Ala204 (оксианионный центр) образуют водородные связи с карбонильным кислородом ацетилхолина, тем самым удерживая ацетильную группу субстрата при нуклеофильной атаке кислорода Ser203 на первой стадии гидролиза. Фиксация положительно заряженной N(CH3)3+ группы ацетилхолина осуществляется посредством ее электростатического взаимодействия с Glu202, а также π-взаимодействия катиона с ароматическими кольцами Trp86 и Tyr337.

Кроме того, важную роль в катализе играют молекулы воды и их ориентация в активном сайте, которая обеспечивается водородными связями с другими аминокислотными остатками [34].

Многочисленные ароматические остатки, выстилающие канал, образуют гидрофобные области, способные связывать алкильные и ароматические группы нейтральных субстратов и соответствующие фрагменты катионных субстратов и ингибиторов.

На поверхности белка у «входа» в каталитическую щель расположен

периферический анионный сайт (ПАС) или β-анионный сайт,который являетсяпервичным сайтом связывания лигандов [35]. Он включает в себя ароматический кластер: Tyr72, Tyr124, Trp286, Tyr341, и отрицательно заряженный остаток Asp74. При высокой концентрации ацетилхолина связывание второй молекулы субстрата с ПАС стерически блокирует освобождение продукта реакции, результатом чего является субстратное ингибирование АХЭ. [35]. ПАС способен связывать различные лиганды, тем

21

самым изменяя конформацию активного центра и регулируя субстратную специфичность фермента. Такая гибкость активного центра и остальных частей белковой молекулы АХЭ обусловливает оптимальную каталитическую активность при различных внешних условиях [36].

Механизм гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ

Общая схема гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ и ключевая роль в нем серина и гистидина были известны еще до определения кристаллографической структуры АХЭ [37, 38, 39]. Полная схема многократно описана [32]. Реакция идет в 2 стадии — ацилирование и деацилирование, и включает в себя образование двух тетраэдрических интермедиатов (Рис. 1.1.-5).

На начальной стадии гидролиза (ацилирование) происходитнуклеофильная атакакислородаSer203по карбонильному атому углеродасубстрата. Одновременно с этим происходит протонирование His447, играющего роль основания в данном процессе. Протонированный гистидин стабилизируется при взаимодействии с глутаматом Glu334. Эти два кислотных остатка, His447–Glu334, составляют так называемую систему переноса заряда (charge-relay system), активирующую серин. Итак, в результате всех этих процессов,Стадия1, происходит образование первого тетраэдрического интермедиата, стабилизированного двумя водородными связями с водородами пептидных связей между глицинами оксианионного центра (Gly121, Gly122). НаСтадии2 первый тетраэдрический интермедиат быстро распадается под действием протонированного гистидина, выступающего в качестве кислоты, с образованием ацилферментного комплекса. НаСтадия3 происходит удаление спиртовой компоненты сложного эфира - холина.Стадия4 - деацилирование ацилферментного комплекса. Ацилфермент подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды, связанной водородной связью с имидазольным кольцом гистидина, в результате образуется второй тетраэдрический интермедиат. Одновременно с этим наСтадии5 происходит протонирование His447, который способствует быстрому распаду отрицательно заряженного

22

тетраэдрического интермедиата с освобождением серина и образованием молекулы уксусной кислоты,Стадия6.

Рис. 1.1. - 5.Схема гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ.

Данная схема катализа аналогична для всех сериновых этераз.

1.1.3. Неклассические функции АХЭ

Одной из неклассических функций АХЭ является ее роль в росте аксонов и формировании синапсов [40, 41], а также в росте злокачественных опухолей

[42, 43, 44].

На примереHelobdella triserialis [45] было установлено, что АХЭ в эмбриональном развитии появляется до развития холинэргической системы передачи нервного импульса, что указывает на некаталитическую роль АХЭ в

23

клеточном развитии и росте нейронов. Предполагают, что на стадии эмбрионального развития АХЭ участвует в процессе регуляции дифференциации нервных клеток [46].

В связи с присутствием АХЭ в кроветворных клетках высказывается предположение о ее кроветворной активности у позвоночных[47, 48].

Было показано, что АХЭ принимает участие в процессе апоптоза – программируемой смерти клетки. Предполагается, что АХЭ участвует в разрушении ядерной оболочки в процессе апоптоза [49].

В работе [50] сообщается, что активность АХЭ является чувствительным индикатором дисфункции печени. Низкая активность этого фермента была обнаружена у пациентов, страдающих тяжелыми заболеваниями печени, такими как острый гепатит и цирроз.

Постоянный мониторинг активности АХЭ необходим для людей, у которых диагностирована фенилкетонурия. В работе [51] было показано, что концентрация фенилаланина и активность АХЭ в крови находятся в обратной зависимости. Авторы предполагают, что это может быть связано либо с непосредственным ингибированием АХЭ фенилаланином, либо с тем, что увеличение концентрации фенилаланина косвенно вызывает нарушения в микросреде липидного бислоя мембраны клеток и, как следствие, изменения состояния фермента.

1.1.4. Заболевания, связанные с АХЭ

Снижение эффективности или нарушение механизма нейропередачи, посредником которой служит ацетилхолин, является одним из факторов развития таких тяжелых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, бульбоспинальный паралич (myasthenia gravis) и др., которые характеризуются снижением когнитивных способностей и/или деградацией нервно-мышечных функций организма.

24

Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (БА) относится к первично-дегенеративным деменциям и характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств. Основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера является разрушение холинергической системы регуляции передачи нервного сигнала Развитие этой болезни связывают, в частности, с низкой активностью фермента, ответственного за синтез ацетилхолина, ацетилхолинтрансферазы, в результате чего происходит снижение концентрации ацетилхолина в синапсах. Основным методом терапии этого заболевания является использование препаратов, способных ингибировать АХЭ (такрин, ривастигмин и др.), что приводит к возрастанию концентрации ацетилхолина в синапсе и продлению его воздействия на рецептор, тем самым восстанавливая баланс в холинэргической системе [52].

Ингибиторы АХЭ были предложены для лечения БА около 20 лет назад и в настоящее время являются основными применяемыми на практике препаратами. Следует отметить, однако, что антихолинэстеразные препараты являются лишь симптоматическими и не останавливают развитие заболевания, а лишь замедляют его прогрессирование и поддерживают качество жизни пациента, продлевая период до наступления полной инвалидизации. В настоящее время разрабатываются препараты, ориентированные на различные механизмы БА [53].

На тяжелых стадиях болезни Альцгеймера наблюдается снижение активности АХЭ, в то же время активность БХЭ повышается, и она частично берет на себя функции АХЭ по гидролизу ацетилхолина. [54-61]. В связи с этим, помимо ингибиторов, селективных для АХЭ, в качестве перспективных терапевтических агентов для лечения БА рассматриваются ингибиторы, селективные как в отношении БХЭ, так и действующие на обе холинэстеразы [56-65]. Более подробно различные типы ингибиторов АХЭ и их

25

терапевтическое применение будут рассмотрены ниже.

Миастенический синдром

При миастеническом синдроме (myasthenia gravis) ослабевает тонус и способность к сокращению скелетных мышцах [66]. Одна из возможных причин — снижение плотности рецепторов ацетилхолина субсинаптической мембраны, что приводит к тому, что потенциал концевой пластинки может не достигать порогового уровня, необходимого для возбуждения мышцы. В этом случае перспективным представляется применение ингибиторов АХЭ, позволяющих увеличить время взаимодействия ацетилхолина с рецептором, и таким образом достичь достаточной деполяризации.

1.1.5. Механизм ингибирования АХЭ

Типы ингибиторов АХЭ

Антихолинэстеразные соединения, в первую очередь, фосфорорганические соединения (ФОС), пролонгируют действие ацетилхолина

отравляющие вещества (БОВ), фосфорорганические пестициды, производные сульфоновой кислоты (например, C6H3CH2SO2F), карбаматы (например, эзерин)

[11].

Ингибиторы АХЭ связываются, как с активным центром фермента: БОВ, фосфорорганические пестициды, карбаматы, в том числе лекарственные препараты - ривастигмин, физостигмин, (такрин, галантамин), обратимые ингибиторы такрин, галантамин, так и с периферическим анионным сайтом (например, гуперзин, донепезил, пропидий, этидий, афлатоксин В1, декаметоний) [67, 68].

26

ингибиторы группы ФОС.

АХЭ является типичной B-эстеразой: ФОС ингибируют ее, в отличие от А-эстераз (например, параоксоназы), которые гидролизуют ФОС [69].

Ингибирование АХЭ приводит к накоплению ацетилхолина в холинергических синапсах и гиперстимуляции мускариновых и никотиновых рецепторов, в результате чего передача нервного импульса нарушается. [70-72].

Признаками острого отравления ФОС являются повышение потливости и слюноотделения, повышение бронхиальной секреции, бронхоспазм, миоз, повышенная моторика желудочно-кишечного тракта, диарея, тремор. Данные симптомы проявляются в течение минут или нескольких часов после воздействия. Выраженность, время проявления и развития клинических симптомов отравления существенно зависит от дозы, длительности контакта с ФОС и эффективности терапевтических мероприятий.

Ингибирование активности АХЭ мозга или нервно-мышечной ткани на 70-90%, как правило, является летальным. [73]. Смерть наступает в результате дыхательной недостаточности вследствие ингибирования дыхательного центра ствола мозга, бронхоспазма и паралича дыхательных мышц [74, 75]. Терапия острых отравлений заключается в применении оксимов, которые реактивируют фосфорилированную АХЭ до того как произошло старение фермента, и атропина - антагониста ацетилхолина, который предотвращает воздействие ацетилхолина на мускариновые рецепторы. В случае тяжелых отравлений также применяют диазепам и проводят искусственную вентиляцию легких [75, 76].

Химическая структура и классификация ФОС подробно обсуждаются в работе [77].

Механизм ингибирования и «старения» АХЭ

Механизмы реакций ингибирования АХЭ и их кинетические аспекты зависят от структуры конкретного ингибитора, что подробно изложено в работах [69, 78-82].

27

ФОС и карбаматы ковалентно связываются с серином активного центра АХЭ, приводя к необратимому ингибированию фермента. [82]. Рассмотрим общую схему взаимодействия ФОС с АХЭ (Рис. 1.1.- 6).

На первом этапе происходит ковалентное связывание ФОС с серином каталитической триады фермента, с образованием конъюгата (фосфорил-фермента), гораздо более прочного, чем при взаимодействии АХЭ с субстратом [7] – Реакция 1. После чего может происходить деалкилирование фрагмента молекулы ингибитора - «старение» фермента, которое приводит к образованию фосфорилированного фермента, неспособного к реактивации в результате расщепления связи R-OP или R-NHP и генерации отрицательного заряда – Реакция 2. При этом реактивация фосфорилированного фермента даже такими сильными нуклеофилами как KF и оксимы становится невозможной. Утрата способности фермента к реактивации называется «старением» фермента.

Помимо этого может происходить спонтанная реактивация фосфорилированного фермента с восстановлением его активности – Реакция 3. Спонтанная реактивация для большинства ФОС протекает очень медленно, так как вода является слабым нуклеофильным агентом. Этот процесс занимает около 60 часов [81]. Реактивация ускоряется под воздействием реактиваторов

— гидроксиламина, оксимов (R—CH=NOH), гидроксамовых кислот. Являясь более сильными нуклеофилами, чем вода, они способны вытеснять фосфорильный фрагмент из активного центра, в результате чего высвобождается свободный фермент. Обидоксим, тримедоксим, пралидоксим и аллоксим используются в качестве коммерчески доступных реактиваторов при терапии острых отравлений ФОС. [76, 83, 84].

28

Ингибирование

1

32

Спонтанная реактивация

«Старение»

Рис. 1.1 .- 6.Схема взаимодействия АХЭ(Е-ОН)с фосфорорганическимисоединениями[85, 86].

Карбаматыв отличие от ФОС обладают высокой скоростью реактивации(Рис. 1.1.-7): карбамоилированный фермент реактивируется в течение 20-60 минут (Реакция 2). Причем фрагмент карбаминовой кислоты, который высвобождается в ходе реактивации, быстро разлагается с получением амина и диоксида углерода (Реакция 3). Старение карбамоилированного фермента не происходит [81, 82].

E-OH +RN

O

1

RN

O

2

R

O+

C

C

+

X

N

C

E-OH

OH-

X

X

R'

X

R'

O-E

R'

OH

3

R

N

H

+ CO2

R'

Рис. 1.1. - 7.Схема взаимодействия АХЭ(Е-ОН)с карбаматами.Реакция 1 – карбамоилирование АХЭ, Реакция 2 - спонтанная реактивация АХЭ, Реакция 3 – разложение карбаминовой кислоты.

29

К веществам, при ингибировании которыми фосфорилированный фермент способен стареть, относятся фосфаты, фосфонаты, амидофосфаты. Фосфинаты, карбаматы, сульфонил фториды – не вызывают старения ингибированного фермента.

Если фосфорилированная АХЭ подверглась старению, ее реактивация невозможна даже с помощью реактиваторов. В данном случае восстановление активности АХЭ в организме происходит только за счет синтеза белкаde novo, что может занять несколько дней [80, 86]. Механизмы ингибирования, реактивации и старения АХЭ активно изучаются [81, 87-89, 90-92].

1.1.6. Токсикологические и фармакологические аспекты ингибирования АХЭ

Боевые отравляющие вещества(Рис. 1.1.- 8) -зарин(GB),зоман(GD),

табун (GB), циклозарин (GF), VX, VR, чрезвычайно опасны в связи с повышенной проникающей способностью в организм человека и высокой токсичностью. БОВ серии G проникают в организм всеми путями и быстро распространяются по организму. Соединения V серии способны быстро проникать через легкие и кожу, при этом V агенты создают субэпителиальные депо, из которых агент медленно высвобождается [93], что обеспечивает его пролонгированное воздействие. Следует отметить, что БОВ, а также фосфорорганические пестициды и карбаматы довольно реакционноспособны, в организме они взаимодействуют и с другими эстеразами [73].

Основной («первичной») мишенью БОВ является АХЭ, ингибирование которой приводит к острой холинергической токсичности, неспецифические эстеразы («вторичные мишени») - БХЭ и КЭ, действуют как стехиометрические скэвенджеры ФОС, и представляют собой места потери активных молекул токсиканта [1, 94, 95], снижая его токсический эффект. Защитная роль каталитических биоскэвенджеров подробно рассмотрена в работе [96].

30

Рис. 1.1. - 8.Структура боевых отравляющих веществ.

Фосфорорганические пестициды,особенно их фосфорильные аналоги,вцелом достаточно токсичны и для теплокровных и хладнокровных организмов в связи с высоким сходством холинэргических систем. [84]. Создание избирательных пестицидов с низкой токсичностью для теплокровных является отдельной важной задачей органической химии и токсикологии [97]. В работе [6] авторы показали, что структура АХЭ эволюционно очень консервативна, и это создает трудности при разработке видоспецифичных ингибиторов АХЭ.

Карбаматыв отличие от ФОС,как уже обсуждалось,обладают высокойскоростью реактивации и не вызывают старения ингибированного фермента. Более того, описано массовое применение физостигмина (эзерин) - природный представитель карбаматов, алкалоид из калабарских бобов Physostigma venenosum - в качестве протекторного средства от возможного отравления БОВ. В 1991 г. в период войны в Аденском заливе физостигмин был введен 400 тыс. американских солдат с целью скоротечного блокирования (и, следовательно, защиты от ингибирования БОВ) АХЭ, так как ожидалась атака армии Ирака с использованием «нервных» газов [98].

Карбаматы широко используются в качестве лекарственных средств для лечения нейродегенеративных заболеваний [99]. Физостигмин и пиридостигмин (Рис. 1.1.-9), повышающие уровень ацетилхолина в

31

синаптической щели, используются в терапииMyasthenia gravis. Быстрая реактивация карбамоилированной АХЭ является основой для применения карбаматов в качестве профилактического средства для защиты от воздействия БОВ, так как карбаматы блокируют необратимое связывание АХЭ с ФОС [92, 100, 101]. Ривастигмин (Exelon) - препарат для симптоматического лечения болезни Паркинсона, а также БА (Рис. 9) [102]. Трихлорфон (метрифонат) (в России - Хлорофос), используемый в последнее время в качестве пестицида, активно исследовался и показал высокую активность в качестве препарата для лечения БА. Однако был снят с исследований на 3-й фазе клинических испытаний из-за нескольких случаев нейропатий [103].

Карбаматы не проникают через гематоэнцефалический барьер, однако в условиях стресса может повыситься их диффузия в центральную нервную систему[104].

ФизостигминПиридостигминРивастигмин

Рис. 1.1. - 9.Карбаматы,применяемые в терапии нейродегенеративныхзаболеваний.

Обратимый ингибитор АХЭ - Такрин (9-амино-1,2,3,4-тетрагидро-акридин) считается одним из наиболее важных ингибиторов активного центра фермента, является симптоматическим средством лечения болезни Альцгеймера (Рис. 1.1.-10). Он известен во всем мире под торговой маркой Cognex. Основным недостатком такрина является его относительно высокая гепатоксичность [105], в связи с чем ведется поиск его менее токсичных производных [106]. В последнее время 7-метокситакрин широко исследуется в качестве перспективного заменителя такрина [107].

32

Галантамин (Нивалин, Рис. 1.1.-10), алкалоид из кавказского подснежника (Galanthus woronowii, Amaryllidaceae), является еще одним хорошо известным препаратом, который взаимодействует с активным центром АХЭ (с α-анионным сайтом). Свойства галантамина впервые были описаны Машковским и Кругликовой-Львовой в 1951 [108]. Наряду с α-анионным сайтом, галантамин связывается с ароматическим кластером каталитической щели АХЭ [109, 110] за счет электростатических взаимодействий[111].

Ряд природных ингибиторов АХЭ как перспективных препаратов для лечения БА рассмотрены в работе [112].

ТакринГалантамин

Рис. 1.1. - 10.Структура такрина и галантамина.

Периферический анионный сайтАХЭ(ПАС)является мишенью многихфармакологически важных соединений, в том числе новых препаратов для лечения БА.

Ингибиторы, специфичные к периферическому анионному сайту АХЭ, считаются не только симптоматическими препаратами в терапии БА, но, вероятно, затрагивают и причину данного заболевания [113]. Показано, что отложение амилоидных бляшек возможно ускоряется или даже индуцируется взаимодействием β-амилоида с периферическим анионным сайтом АХЭ [114, 115]. Таким образом, ингибирование АХЭ по периферическому анионному сайту при БА, способствует не только поддержанию необходимого уровня ацетилхолина в синаптической щели, но также может замедлить агрегацию β-амилоида. Ингибирование периферического анионного сайта является

33

перспективным подходом для лечения БА. Коммерчески доступные препараты, ингибирующие АХЭ по периферическому анионному сайту, представлены алкалоидами Гуперзином A и B и синтезированным соединением донепезил. Донепезил (торговое название Aricept) хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и медленно экскретируется. Структуры гуперзина и донепезила изображены на (Рис. 1.1.-11).

Гуперзин АДонепезил

Рис. 1.1. - 11.Ингибиторы периферическогоβ-анионного сайта АХЭ.

Декаметоний - бис-четвертичный аммониевый ингибитор ПАС АХЭ «растягивается» внутри каталитической щели, связываясь одной из своих четвертичных аммонийных групп с ароматическим кластером каталитической щели за счет катион-π взаимодействий, а другой группой связывась с ПАС у входа в каталитическую щель, таким образом являясь ингибитором этих двух сайтов. [32]. Широко применяется в исследовательских целях для изучения сайт специфических взаимодействий.

Декаметоний

Этиология БА полностью не раскрыта, и антихолинэстеразная терапия не излечивает БА, а лишь замедляет ее развитие. Ингибиторы АХЭ - донепезил, ривастигмин, галантамин, такрин и антагонист глутаматных N-метил-D-аспартат (NMDA)-рецепторов, мемантин, являются в настоящее время

34

единственными препаратами, применяемыми для симптоматического лечения БА [116 -119].

Фактическая роль АХЭ в развитии данного заболевания, а также применение сайтспецифических ингибиторов для терапии БА широко исследуется [120, 121].

АХЭ как биомаркер воздействия антихолинэстеразных соединений

Непосредственная опасность, вызываемая ФОС, связана состройхолинергической токсичностью,возникающей в результате ингибированияАХЭ в холинергических синапсах центральной и периферической нервной системы [122]. Активность АХЭ эритроцитов отражает ситуацию в тканях-мишенях (особенно в периферических отделах, например, в нервно-мышечных соединениях) [123] и может рассматриваться как подходящий биомаркер для биологического мониторинга воздействия ФОС. Определение активности АХЭ и БХЭ в крови и плазме, соответственно, является удобным методом мониторинга воздействия ФОС и широко применяется в клинической токсикологии [85, 124].

35

  1. Бутирилхолинэстераза

  1. Физиологическая функция и локализация БХЭ

Бутирилхолинэстераза (БХЭ, КФ 3.1.1.8), также называемая сывороточная холинэстераза или псевдохолинэстераза, в изобилии присутствует в плазме крови человека (3 мг/литр), ее период полужизни составляет 12 дней [125, 126]. БХЭ присутствует практически во всех тканях организма — печени, кишечнике, поджелудочной железе, плаценте, сердце, в центральной и периферической нервной системе и т. д. [127]. Сывороточная БХЭ синтезируется в печени и оттуда поступает в кровоток. В норме активность БХЭ в крови человека находится в диапазоне 0.9-12 Ед/мл (по бутирилтиохолину)[128-130].

Физиологическая рольБХЭ до сих пор до конца не ясна.В отличие отАХЭ, у БХЭ нет уникальной физиологической функции, которая не могла бы быть компенсирована другими ферментами. Люди, не имеющие активности БХЭ здоровы, фертильны и доживают до старости [131]. Эксперименты на нокаутных по гену БХЭ мышах показали также, что полное отсутствие активности БХЭ не влияет на здоровье и плодовитость животных [132].

Суммарно в организме человека и мыши БХЭ содержится в среднем в 10 раз больше, чем АХЭ [24, 131]. Наиболее высокие концентрации БХЭ обнаружены в печени, плазме крови, коже, легких, тонком кишечнике, что свидетельствует о защитной роли фермента, его участии в детоксикации ксенобиотиков, поступающих в организм с пищей и воздухом [32, 131].

Субстратная специфичность БХЭ

БХЭ обладает более широкой субстратной специфичностью по сравнению с АХЭ. БХЭ гидролизует эфиры холина, тиохолина, ароматические и другие органические эфиры. [133], она наиболее специфична к бутирилхолину (KМ = 0.14 мМ) и значительно в меньшей степени к ацетилхолину (KМ = 1.2 мМ).

36

Более широкая субстратная специфичность БХЭ по сравнению с АХЭ определяется размерами и некоторыми структурными особенностями активного центра БХЭ, которые мы обсуждаем ниже.

Cпецифическим ингибитором БХЭ является этопропазин. [134, 135]. Iso-OMPA часто используется как специфический ингибитор БХЭ, но только в малых концентрациях, высокие концентрации iso-OMPA ингибируют также и КЭ [32].

1.2.2. Генетический полиморфизм БХЭ

Единственный ген БХЭ человека расположен на хромосоме 3 в регионе3q26.1–q26.2на минус-нити[136].Уровень экспрессии гена БХЭ в4раза вышесреднего.

Для БХЭ, в отличие от АХЭ, описано большое число случаев полиморфизма [137]. Большинство идентифицированных генетических вариантов являются «молчащими», то есть они имеют нулевую активность или менее 10% от уровня нормальной активности. Известно порядка тридцати «молчащих» мутаций [137-139]. БХЭ плазмы крови человека помимо обычной формы (U) имеет около 9 фенотипических изоформ [140, 141]. К ним относятся «атипичные» (A), «молчащие» (S), фторидрезистентные (F), а также К (Kalow)

отношению к ингибированию в присутствии F--ионов, дибукаина и 2-гидрокси-5-фенилбензилтриметил-аммонийбромида [141].

37

Таблица. 1.2. - 1.Генетические варианты БХЭ.

Общепринятое

Фенотипическое

наименование

Мутация

Источник

проявление

фермента

Обычный

нет

нормальный

(usual)

Атипичный

Asp-70-Gly

устойчив к ингибировании.

[142]

дибукаином, активность

(atypical)

снижена на 75%

Неактивный

Gly-117-сдвиг рамки

не проявляет

[143]

считывания на одно

холинэстеразной

(«молчащий»)

основание

активности

Фторид-

Gly-390-Val/

устойчив к ингибированию

[144]

1/Фторид-2

Thr-243-Met

фторидом

K-вариант

Ala-539-Thr

Активность снижена на 33%

[145]

J-вариант

Glu-497-Val

Активность снижена на 66%

[146]

H-вариант

Val-142-Met

Активность снижена на 90%

[147]

В настоящее время продолжается исследование полиморфизма БХЭ [140,

148-150].

Наиболее важной с клинической точки зрения является атипичная форма БХЭ (замена Asp70Gly) [142]. Люди с атипичной БХЭ обладают ненормальной реакцией на введение мышечного релаксанта кратковременного действия сукцинилдихолина (апноэ и длительный паралич [142, 151, 152]. Сукцинилхолин относится к группе деполяризующих миорелаксантов, по структуре он напоминает ацетилхолин, и аналогичным образом действует на постсинаптическую мембрану, вызывая ее деполяризацию. В клинической практике он также известен под названиями дитилин и листенон. Сукцинилхолин не гидролизуется АХЭ в синаптической щели, но быстро гидролизуется БХЭ плазмы, что и определяет кратковременность мышечной релаксации - порядка 2–3 минут. Атипичная БХЭ (Asp70Gly) гидролизует сукцинилхолин с заметно более низкой скоростью, что приводит к существенному увеличению времени блокады нервно-мышечной проводимости

38

и длительному параличу дыхательных мышц вплоть до летального исхода [152, 153]. Также выявлена реже встречающаяся полиморфная модификация Asp70His, приводящая к тому же эффекту при взаимодействии фермента с сукцинилхолином [154].

Для предотвращения негативных последствий введения сукцинилхолина пациентам с атипичной БХЭ, иногда вводят «нормальную» БХЭ [155].

Установлено, что 76% людей имеют обычный генотип, а остальные 24% несут, по крайней мере, один генетически измененный аллель. В Америке и Европе частота встречаемости гомозиготного атипичного генотипа (AA) невелика - 0,04%, гетерозиготные варианты встречаются чаще — 0,4–0,5%. Вариант К более распространен: гетерозиготным носителем является 1 житель США из 4, а гомозиготный вариант несет 1 из 64 [145]. Носителями «молчащих» вариантов в Америке являются 0,8% обследованных.

Следует отметить, что в нормальных условиях при отсутствии каких-либо заболеваний и воздействия химических веществ, полиморфные мутации и даже отсутствие экспрессии БХЭ не сказывается на здоровье человека [131]. Однако, люди с низкой активностью БХЭ или с ее отсутствием обладают пониженной способностью к связыванию и детоксикации ФОС и других антихолинэстеразных соединений, таким образом они являются более восприимчивыми к токсическому действию данных соединений. Такие пациенты имеют большой риск развития как острых, так и отставленных нейротоксических эффектов, вызываемых данными соединениями [137].

1.2.3. Структура БХЭ

Секретируемый фермент представлен глобулярными, водорастворимыми (гидрофильными) формами G1, G2 и G4, которые состоят, соответственно, из одной (мономер), двух (димер) или четырех (тетрамер) субъединиц. Субъединица фермента является сиалогликопротеидом с молекулярной массой 85 кДа, состоящей из 574 аминокислот и 9 углеводных цепочек, на долю которых приходится 24% веса белка. Субъединицы в димере связаны

39

дисульфидными связями остатков цистеина. 95% активности БХЭ плазмы приходится на долю тетрамеров [156].

Структурные особенности активного центра БХЭ

Аминокислотные последовательности АХЭ и БХЭ гомологичны на 53%, их структуры и каталитические механизмы также сходны, однако ферменты различаются по субстратной специфичности и сродству к различным ингибиторам [157, 158].

Оба фермента имеют длинный, ~20Å гидрофобный канал, содержащий активный центр. Как и в случае АХЭ, в активном центре БХЭ можно выделить

5 сайтов [159, 160]:

Шесть из 14 ароматических остатков, которые выстилают каталитическую щель активного центра АХЭ, заменены у БХЭ на меньшие по размеру алифатические аминокислоты, что делает активный центр БХЭ более объемным (500 Å) по сравнению с активным центром АХЭ (300 Å), и позволяет вмещать более широкий спектр субстратов и ингибиторов [31, 46] (Рис. 1.2.-1). Так, Phe295 и Phe297, присутствующие в АХЭ, заменены на лейцин и валин, соответственно, что позволяет бутирилхолину и бутирилтиохолину помещаться

40

в ацил-связывающем кармане.

Периферический анионный сайт БХЭ, расположенный на краю каталитической щели, включает лишь два аминокислотных остатка, Asp70 и Tyr332, и не имеет ароматического кластера подобного АХЭ (Trp286, Tyr72, Tyr124, Phe338). Замена Trp286 (у АХЭ) на Ala (у БХЭ) приводит к падению ингибирующей активности лигандов, занимающих периферический анионный сайт БХЭ [161], что объясняет слабое связывание ингибиторов АХЭ - пропидиума и фасцикулина, с БХЭ.

Для БХЭ характерна субстратная активация положительно заряженными субстратами, избыток субстрата не подавляет активность БХЭ [162, 163], в отличие от АХЭ, для которой показана стерическая блокада субстратом [35,

164].

БХЭ, как и АХЭ, гидролизует преимущественно положительно заряженные субстраты. Asp70 периферического анионного сайта, несущий отрицательный заряд является ключевым аминокислотным остатком, отвечающим за связывание лигандов (в случае АХЭ - Asp74). Согласно кристаллографическим данным [165], Asp 70 находится в канале, ведущем от поверхности белка к активному сайту (аналогичном каналу в молекуле АХЭ) на расстоянии 12Å от поверхности белка.

Отрицательно заряженные субстраты, например, аспирин, БХЭ гидролизует вдвое медленнее, чем ацетилхолин [166].

Показано, что трехмерная структура БХЭ человека [159] и структуры АХЭ ската и дрозофилы очень близки. Основные цепи АХЭ и БХЭ практически совпадают, а различия в боковых цепях создают в канале БХЭ дополнительный объем по сравнению с АХЭ (Рис. 1.2.-1) [161].

41

Trp286

Phe297

Phe295Tyr124

Tyr72

Phe338

Рис. 1.2. - 1.Наложение структур АХЭ(PDB ID 2ACE,сиреневый цвет)и БХЭ(PDB ID 1P0I, голубой цвет). Зеленым показаны 6 ароматических аминокислот в каталитической щели АХЭ, отсутствующие у БХЭ (по данным PDB, www.rcsb.org).

1.2.4. Биологическая роль БХЭ

Как мы уже отмечали, физиологическая функция БХЭ до сих пор не выяснена. Гидролизуя различные соединения и связываясь с ФОС, БХЭ выполняет в организме в первую очередь защитные функции, а также участвует в метаболизме лекарственных препаратов [163, 167].

Есть данные, что БХЭ играет также определенную роль в развитии сахарного диабета 2 типа [168, 169].

БХЭ является одной из эстераз, которая инактивирует аппетит-стимулирующий гормон октаноил-грелин, превращая его в неактивную форму (чистый пептид – грелин). Роль БХЭ в жировом обмене подтверждается в экспериментах наБХЭ(-/-) мышах, у которых развивалось ожирение при

42

получении кормов с высоким содержанием жира в отличие от животных дикого типа [170, 171].

  1. Роль БХЭ в метаболизме лекарственных препаратов

Так, БХЭ гидролизует целый ряд сложноэфирных предшественников лекарств (prodrugs), тем самым участвуя в процессе их метаболической активации. В частности, БХЭ превращает пролекарство бамбутерол в тербуталин – бронходилятатор длительного действия, препарат для лечения астмы [174]. Также БХЭ вместе с карбоксилэстеразой превращает пролекарство СРТ-11 (иринотекан) в активный противоопухолевый препарат SN-38[175,176]. Терапевтический эффект подобных лекарственных средств зависит от уровня активности БХЭ в организме.

БХЭ плазмы является также основным ферментом, гидролизующим миорелаксанты сукцинилхолин и мивакурий, обеспечивая таким образом кратковременность их действия [138, 177, 178]. Также БХЭ участвует в биотрансформации прокаина [179], ацетилсалициловой кислоты [180], героина.

[181].

Основным метаболическим путем детоксикации и выведения кокаина из организма человека является его гидролиз под действием БХЭ [182-186], продукты гидролиза – экгонин и бензойная кислота, биологически неактивны. [182, 184, 187]. Только 5% кокаина детоксицируется окислением микросомальным цитохромом P450 в печени. В связи с этим лечение передозировки кокаина при помощи препаратов на основе БХЭ является

43

перспективным терапевтическим подходом [188, 189].

1.2.4.2. Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС

Сывороточная БХЭ способна осуществлять связывание многих токсичных ФОС и карбаматов, поступивших в организм извне, выступая в роли биоскэвенджера. ФОС токсиканты реагируют с БХЭ по тому же механизму, что

Профилактическое введение сывороточной БХЭ человека или рекомбинантной БХЭ человека грызунам, морским свинкам и нечеловекообразным приматам защищает их от смертельных доз зарина, зомана

44

ФОС [163, 167, 195, 196]. Некоторые из таких препаратов (сывороточная БХЭ человека и рекомбинантная форма фермента, полученная из молока трансгенных коз) прошли I фазу клинических испытаний [196-198]. Однако, основным ограничением биоскэвенджеров первого поколения является стехиометрический механизм взаимодействия между ферментом и молекулой ФОС (1:1).

Определение активности БХЭ в цельной крови (или плазме) обычно используют в качестве чувствительного биомаркера воздействия ФОС [199]. Оценка активностей обеих холинэстераз, АХЭ и БХЭ, является необходимым условием правильного подбора антидота для людей, подвергшихся воздействию боевых отравляющих веществ. [200, 201]. Правильное и своевременное установление уровня активности холинэстераз позволяет выбрать оптимальный антидот и его количество, что предотвращает развитие тяжелых последствий отравления.

1.2.4.3. Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера

Помимо плазмы, БХЭ широко представлена в нервной системе, что указывает на ее роль в нейрональных функциях. В человеческом мозге, как АХЭ, так и БХЭ находятся в нейронах и в клетках глии, а также в нейритных бляшках и нейрофибриллярных клубках у пациентов с БА [202, 203]. Есть свидетельства важной роли БХЭ в холинергической нейротрансмиссии и участия в развитии нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера [56-58, 169].

В здоровом мозге человека, активность АХЭ выше, чем активность БХЭ. При развитии БА активность АХЭ постепенно снижается, в то время как активность БХЭ возрастает [204]. По мере прогрессирования болезни, баланс между ферментами смещается в пользу БХЭ, увеличивая ее функциональное значение в регулировании уровня ацетилхолина [47]. В связи с этим использование ингибиторов БХЭ на поздних стадиях БА имеет важное значение для поддержания когнитивных функций и качества жизни пациентов

45

[55, 203]. В экспериментах на грызунах было показано, что селективные ингибиторы БХЭ, улучшают когнитивные функции у старых животных за счет увеличения уровня ацетилхолина в мозге и тем самым могут быть полезны в лечении БА [59, 204-206].

210].

Другие ингибиторы, действующие избирательно на БХЭ, включают бензофураны [211] и производные изосорбида [212-214], причем последняя группа включает в себя наиболее мощные и селективные ингибиторы БХЭ

[213].

Производные фенотиазина - еще один химический класс ингибиторов БХЭ [215-218], которые, как известно, обладают также антипсихотическими и антигистаминными свойствами. В последнее время получены и охарактеризованы диарилимидазолы (diarylimidazoles) как гибридные ингибиторы гидролазной активности БХЭ и формирования фибрилл β-амилоида [208], а также тиенотиазины (thienothiazine), сходные по структуре с фенотиазинами [219].

46

***

Таким образом, холинэстеразы (АХЭ и БХЭ) играют важнейшую роль в организме человека. На данный момент накоплен огромный объем информации относительно их структуры и свойств, вместе с тем множество вопросов остается открытым. Ведутся активные исследования функционирования холинэстераз, как в здоровом организме, так и при нарушениях различной этиологии, проводится активная разработка фармацевтических препаратов на основе холинэстераз и их селективных ингибиторов.

47

  1. Нейротоксичная эстераза

  1. Физиологическая роль и локализация НТЭ

Нейротоксичная этераза (НТЭ, КФ 3.1.1.5) – фермент нервной ткани теплокровных, который является мишенью нейропатичных ФОС, способных ее необратимо ингибировать c последующим быстрым старением фосфорилированного фермента, и инициировать тем самым развитие опасного синдрома «отставленной нейротоксичности, вызываемой ФОС» (ОНТФОС). Это практически необратимое поражение, обусловленное дистальной дегенерацией сенсорных и моторных аксонов в периферических нервах и спинном мозге [221-226]. Возможные механизмы развития ОНТФОС и роль НТЭ мы подробно обсуждаем ниже.

НТЭ экспрессируется в основном в нейронах, но также обнаружена в ненейрональных клетках, в том числе в лимфоцитах и клетках Лейдига [227,

228].

Физиологическая роль НТЭокончательно не выяснена.В настоящеевремя НТЭ классифицируется как лизофосфолипаза (EC 3.1.1.5) в связи с тем, что она гидролизует лизофосфосфолипиды (продукты гидролиза цитозольной фосфолипазы А2 - PLA2) до глицерофосфатов [229-233]. НТЭ также может действовать и как фосфолипаза, однако преимущественно гидролизует именно лизофосфатидилхолин до глицерофосфохолина [231]. Таким образом, НТЭ играет важную роль в липидном гомеостазе мембран.

Показано, что SWS протеин, обнаруженный в мозге Drosophila и имеющий высокую степень гомологии с НТЭ человека, является необходимым для процесса развития мозга уDrosophila [234, 235]. О возможной роли НТЭ в процессе нейронального развития теплокровных говорит наличие НТЭ в нейронах мыши на самых ранних стадиях их появления в нервной системе [236]. Подтверждением этой гипотезы являются исследования на нокаутных мышахНТЭ (-/-) [228]. Такие мыши погибали на 8-й день эмбрионального развития. Тотальная делецияНТЭ у таких мышей вызывает эмбриональную

48

смерть в связи с нарушениями при формировании плаценты и недостаточностью васкуляризации [238, 237].

НейрональныеНТЭ нокаутные мыши (nestin-cre:NTEfl/fl mice), у которых удаление генаНТЭ происходит только в нервной ткани на 11-й день эмбрионального развития [239], доживают до взрослого возраста. Однако у таких мышей наблюдается вакуолизация и гибель нейронов, характерные для нейродегенеративных заболеваний [238].

Эксперименты на нокаутных по генуНТЭ мышах (НТЭ-/-) показали, что НТЭ необходима для развития и поддержания различных клеток и тканей, в том числе крупных нейронов в гиппокампе и мозжечке [239].Кроме того, хотяНТЭ +/-мыши,имеющие примерно половину нормального уровня НТЭ,выживают и, вероятно, имеют нормальное морфологическое развитие нервной системы; они проявляют гиперактивность и повышенную чувствительность к воздействию нейропатичных соединений [239].

Ряд работ указывает на то, что НТЭ участвует в межклеточном сигнальном пути между нейронами и глиальными клетками [240, 231, 241]. В экспериментах наnestin-cre:NTEfl/fl мышах и культуреНТЭ-дефицитных нейронов показана роль НТЭ в гомеостазе фосфатидилхолина в нервной ткани и поддержании (сохранении) аксонов, а также в аксональном мембранном транспорте: присутствие НТЭ в мембране ЭПР нейронов облегчает транспортировку макромолекул к дистальным участкам длинных аксонов [242].

Matsuzaka Y. с соавторами [243] показали роль НТЭ в развитии синдрома больного здания (Sick Building Syndrome, SBS). Этот термин объединяет набор неспецифических симптомов, которые возникают без каких либо видимых причин: головные боли, усталость, вялость, тошнота, раздражения глаз и горла, головокружение, боли в спине и суставах и нарушения сна. Предполагается, что SBS может быть вызван воздействием целого ряда факторов, находяшихся внутри помещений [244, 245], причиной может являться неблагоприятная «внутренняя окружающая среда». При исследовании японской популяции показано, что в группе пациентов с SBS активность НТЭ значительно

49

повышена по сравнению с контрольной группой.

Было также показано повышение транскрипционной активности НТЭ в периферических моноцитах у пациентов с синдромом хронической усталости chronic fatigue syndrome (CFS) [246]. Симптомы CFS имеют много сходства с симптомами SBS [247]. Предполагается, что SBS и CFS имеют перекрывающихся причины возникновения и сходные молекулярные механизмы. В целом, эти результаты показывают, что активность НТЭ может являться важным маркером при исследовании SBS. Тем не менее, дополнительные исследования различных популяций населения, генетических и экологических факторов необходимы для подтверждения роли НТЭ в патогенезе SBS.

Субстратная специфичность и методы оценки активности НТЭ

Специфический субстрат НТЭ неизвестен. НТЭ хорошо гидролизует некоторые гидрофобные искусственные субстраты: ароматические эфиры карбоновых кислот (но не объемные α – нафтиловые) и ароматические эфиры ω

– фенилалкилкарбоновых кислот [248]. В качестве субстратов для определения активности НТЭ могут использоваться фенилфенилацетат, нитрофенилвалерат и фенилвалерат [221] из которых последний имеет наилучшее сочетание чувствительности и специфичности при соответствующих условиях анализа [249]. В нервной ткани содержится несколько эстераз, гидролизующих фенилвалерат, причем активность НТЭ составляет около 10% от общей фенилвалерат-гидролизующей активности. В связи с этим активность НТЭ может быть определена методом дифференциального ингибирования с использованием нейропатичного соединения - мипафокса (N,N’-диизопропиламидофторфосфат) и соединения, не вызывающего ОНТФОС - параоксона -О,О-диэтил-О-(4-нитрофенил) фосфата. Активность НТЭ определяется как часть нечувствительной к параоксону эстеразной активности, которая чувствительна к мипафоксу. Так, если А - общая фенилвалерат-гидролизующая активность, В – параоксон-резистентная активность, С –

50

(параоксон+мипафокс) - резистентная эстеразная активность, то активность НТЭ определяется как (В - С) (Рис. 1.3.-1). Определение активности НТЭ в головном и спинном мозге обычно проводят в соответствии с дифференциальным метода Johnson, 1977 [250], в периферических нервах тем же методом с некоторыми модификациями [251].

, %

100

A

активность

90

20 мин, 370С

фенилвалератгидролазная

20

B

активность НТЭ

10

(В - С)

0

C

PO

PO+MX

резистентная

активность

Рис. 1.3. - 1.Стандартная схема определения активности НТЭ методомдифференциального ингибирования согласно Johnson, 1977 [250].

1.3.2. Структура НТЭ

НТЭ - интегральный белок мембраны эндоплазматического ретиуклума, причем большая часть молекулы ориентирована на цитоплазматической поверхности мембраны [252].

НТЭ существует в двух формах. Распределение этих форм в тканях различно: в мозге 90% активности НТЭ наблюдается в микросомах и около 10% в цитозоле, в то время как в седалищном нерве около 45 % активности НТЭ наблюдается в микросомах и 55% в цитозоле. Эти две формы НТЭ демонстрируют разную чувствительность к мипафоксу: для микросомальной формы IC50 = 7 мкМ, для цитозольной около 43 мкМ [253].

Третичная  структура  НТЭ  до  сих  пор  не  определена  в  связи  со

51

сложностью кристаллизации молекулы белка, отчасти из-за большого размера (1327 аминокислотных остатков) и крепления в мембране ЭПР [223, 252]. В связи с этим рассматриваются альтернативные стратегии структурного анализа, включая компьютерное моделирование дискретных доменов белка.

НТЭ человека представляет собой полипептид, состоящий из 1327 аминокислотных остатков с молекулярным весом 146 kDa, и имеющий два функциональных домена [234, 254] (Рис.1.3. - 2.):

  1. N-концевой домен, выполняет, по-видимому, регуляторную функцию и состоит примерно из 700 аминокислотных остатков. Аминокислотные остатки от 10 до 32 образуют трансмембранную спираль (TMD), аминокислотные остатки 163–262, 480–573 и 597–689, формируют 3 фрагмента, сходных с цАМФ-связывающими белками (CNP 1-3, соответственно);

  1. С-концевой каталитический домен (остатки 933-1099), содержит активный серин (Ser-966), взаимодействующий с ФОС. Этот домен имеет 30 % гомологии

Результаты молекулярного моделирования [254] и направленного мутагенеза [234, 240] показали, что каталитический центр НТЭ состоит из диады Ser-966 – Asp-1086 аналогично активному центру цитозольной фосфолипазы А2 (PLA2) и фосфолипазы растений – пататин-17 в отличие от классической триады сериновых гидролаз Ser-Asp/Glu-His. В связи с этим НТЭ относят к семейству фосфолипаз, содержащих пататин-подобный домен

(PNALA, patatin-like phospholipase domain-containing proteins), состоящему из 9

белков, где НТЭ классифицируется как PNALA6 [255].

Интересно, что НТЭ (PNPLA6) и PNPLA7 (NTE-related protein, NRE),

которая, как было показано, регулируется инсулином и глюкозой [256], имеют идентичные на 61% аминокислотные последовательности и одинаковую доменную структуру, отличаясь тканевым распределением [255]. Cходство между НТЭ (PNPLA6) и PNPLA7 предполагает возможность регулирования белка НТЭ и/или кодирующего его гена инсулином и глюкозой, а также

52

потенциальную роль НТЭ в патогенезе диабетической нейропатии: частое осложнение диабета, включающее дистальную симметричную дегенерацию аксонов [257].

Цитозоль

Просвет ЭПР

Трансмембранный  цАМФ-связывающиеPatatin домен

домендомены

Рис. 1.3. - 2.Модель третичной структуры НТЭ[254].

Минимальный полипептид, содержащий эстеразный С-домен (аминокислотные остатки 727-1216) и обладающий чувствительной к ФОС фенилвалерат-эстеразной активностью, был экспрессирован вE.coli [240, 258]. Этот рекомбинантный полипептид, названный NEST, является чрезвычайно гидрофобным, и требует включения в фосфолипидные липосомы для проявления каталитической активности. Он активно используется для исследования механизма функционирования НТЭin vitro [258, 259].

53

P.Glynn [260] с соавторами (1999) показали, что первичная аминокислотная последовательность НТЭ человека имеет весьма низкую степень гомологии с АХЭ и другими сериновыми гидролазами. Вместе с тем обнаружена высокая степень гомологии НТЭ человека с белками SWS (Drosophila), YOL4 (C.elegans), YMF9 (yeast), mtcy20B11.14c (M.tuberculosis), YCHK (E.coli), [261, 260].

1.3.3. Синдром отставленной нейротокичности, вызываемой ФОС (ОНТФОС)

Характеристика и эпидемиология ОНТФОС

Как мы уже упоминали, развитие синдрома отставленной нейротоксичности связано со способностью некоторых ФОС необратимо ингибировать НТЭ с последующим быстрым старением фосфорилированного фермента [223, 262, 263]. Это привело к выделению ОНТФОС в качестве отдельной нозологической единицы - согласно классификатору ВОЗ это дистальные нейропатии, вызываемые фосфорорганическими соединениями.

В основе патологии ОНТФОС лежит билатеральная симметричная дегенерация сенсорных и моторных аксонов в дистальных областях периферических нервов и спинного мозга. При этом поражаются прежде всего наиболее длинные аксоны с максимальным диаметром [223, 225]. Наиболее выраженные дегенеративные изменения часто находят в dorsal columns грудного отдела спинного мозга. Считалось, что дегенерация начинается с миелиновой оболочки длинных аксонов. Это нашло отражение в термине «демиелинизирующие ФОС». Однако в дальнейшем было показано, что патологический процесс начинается с поражения ствола нерва, а демиелинизация вторична [264].

Характерным для ОНТФОС является наличие латентного (скрытого) периода перед началом клинических проявлений длительностью 1-3 недели [222, 223]. При этом клинических признаков острого отравления может не

54

быть, особенно если токсикант обладает слабым антихолинэстеразным действием.

Первые клинические симптомы поражения аксонов (аксонопатии) проявляются не раньше, чем на 7-8 день после отравления нейропатичным ФОС (обычно через 7-14 дней после отравления) и заключаются в расстройстве чувствительности, слабости и онемении нижних, а затем и верхних конечностей. Параллельно с этим становится очевидным нарушение координации движения и к 20-21 дню после отравления может развиться частичный паралич конечностей. Специфические методы лечения ОНТФОС отсутствуют, выздоровление редко бывает полным [265]. Следует отметить, что это заболевание не связано с ингибированием АХЭ, и, следовательно, ОНТФОС могут вызывать те соединения, которые не обладают высокой острой токсичностью, и не вызывают сразу при отравлении настораживающих признаков острой токсичности, например триортокрезилфосфат, использование которого в промышленности практически не регламентировано. Кроме этого, ОНТФОС может потенцироваться или промотироваться другими соединениями, присутствующими в окружающей среде [264, 266 267].

Для ОНТФОС характерен ряд особенностей, отличающих это заболевание от периферических нейропатий (аксонопатий), вызываемых некоторыми лекарственными препаратами – сульфаниламидами, изониазидом, пиридоксином, а также тяжелыми металлами, сероуглеродом, акриламидом, гексаном и его производными [268]. Эти особенности включают: четко дифференцированные временные характеристики, характерные патоморфологические изменения; выраженную видовую специфичность – человек и куры являются наиболее чувствительными видами, наименьшую чувствительность проявляют грызуны [190, 264]; выраженную возрастную специфичность: молодые животные значительно менее чувствительны к ОНТФОС [264, 266, 269, 270]. Дети также менее чувствительны к действию нейротоксичных ФОС [271, 272].

Описано более 70000 случаев ОНТФОС за последние 70 лет, причем

55

большинство из них вызвано триортокрезилфосфатом – соединением с низкой острой токсичностью, широко используемым в качестве пластификатора, любриканта и антифлогистика [190, 253, 273]. Зарегистрированы случаи полинейропатий, вызванных пестицидами: лептофосом, галоксоном, изофенфосом, метамидофосом, хлорпирифосом, мипафоксом [190, 222, 273].

Есть основания полагать, что ОНТФОС на самом деле явление более частое, чем это принято считать, в том числе и потому, что своевременный и правильный диагноз нередко упускают из-за размытости клинической картины и отсутствия четких диагностических критериев.

Видовая чувствительность к нейропатичным ФОС

Взрослые куры и кошки являются наиболее чувствительными животными: нейропатии вызываются у них при однократном воздействии ФОС с различным нейропатичным потенциалом. Человек, по-видимому, единственный из приматов, у которого ОНТФОС вызывается однократной дозой нейротоксиканта.

Данные по видовой чувствительности к нейротоксичным ФОС представлены в Таблице 1.3.-1.

Грызуны считаются нечувствительными или малочувствительными к ОНТФОС из-за сложности получения клинической картины – атаксии. По мнению [262] меньшая чувствительность грызунов к воздействию нейропатичных ФОС является результатом «стабильности физиологии нейрона». Однако работы S.Padilla, B.Veronesi и M. Ehrich показали, что при отсутствии клинических симптомов поражения у крыс при введении стандартных нейротоксикантов – ТОКФ и мипафокса – наблюдаются характерные для ОНТФОС биохимические и патоморфологические изменения, и механизм инициирования ОНТФОС также одинаков для кур и грызунов [262, 274-280].

56

Таблица 1.3. - 1.Видовая чувствительность животных к действиюнейротоксичных ФОС [262].

Вид

Соединение

Нейропатия

Однократное введение

Человек

ТОКФ, мипафокс, хлорофос,

+

трихлоронат, метамидофос, лептофос

Куры

Все известные нейротоксиканты

+

Кошка

ТОКФ,

+

о-крезилсалигенинциклофосфат

Корова

ТОКФ

+

Водяной буйвол

Лептофос

+

Овца

Галоксон, лептофос, дихлофос

+

Свинья

Галоксон

+

Коза

ТОКФ

+

Повторные введения

Павиан

ТОКФ

+

Макака-резус

ТОКФ

+

ДФФ

-

Беличья обезьяна

ТОКФ

+

Мартышка

Фенилсалигенинциклофосфат

-

Собака

ТОКФ, ДФФ

+

Кролик

Мипафокс

+

Крыса

Мипафокс

+

моно-о-крезилфосфат

-

Показано также, что клинические проявления ОНТФОС у крыс являются возраст-зависимыми, как и у кур [269, 281].

Таким образом, механизм ОНТФОС у грызунов и кур аналогичен: молекулярная мишень – НТЭ, присутствует в нервной ткани у обоих видов, ингибируется соответствующими нейропатичными дозами ФОС, ингибированный фермент «стареет» [262, 275, 280]. «Стабильность» нейронов у грызунов не является абсолютной и зависит от возраста животных.

57

Высокая чувствительность кур к действию отставленных нейротоксикантов наряду со схожестью гистопатологических изменений и одинаковой длительностью латентного периода у кур и человека, а также простотой клинической картины поражения привели к выбору кур в качестве стандартного тест-объекта для исследования ОНТФОС. Существенным фактором является и то, что банк данных по ОНТФОС накоплен в основном по результатам опытов на курах [262, 265, 282].

1.3.4. Роль НТЭ в механизме инициирования ОНТФОС

1.3.4.1. Ингибирование и «старение» НТЭ

Впервые M. Johnson в 1969 [283] году показал, что молекулой - мишенью в механизме инициирования ОНТФОС является один из белков нервной ткани, обладающий эстеразной активностью и относящийся к сериновым гидролазам -

нейротоксичная эстераза (НТЭ) (neuropathy target esterasе, neurotoxic esterase, NTE) [262, 282, 283]. Полагают, что ОНТФОС инициируется путем фосфорилирования НТЭ и последующего старения фосфорилированного фермента [79, 190, 262-265]. При этом реактивация фосфорилированного фермента даже такими сильными нуклеофилами как KF и оксимы становится невозможной.

К веществам, способным индуцировать развитие ОНТФОС, относятся фосфаты, фосфонаты, амидофосфаты – группа А (Табл. 1.3.-2). Эти соединения образуют фосфорилированый фермент, способный стареть в результате расщепления связи R-OP или R-NHP [190, 284], причем порогом для последующего развития ОНТФОС у экспериментальных животных (куры) является 70-80% ингибирования НТЭ [190, 262, 265].

58

Таблица 1.3. - 2.Типы ингибиторов НТЭ: А-соединения способные стареть; Б-соединения,при действии которых ингибированная НТЭ не стареет.

Группа А

Группа Б

Потенциальные нейропатичные

Защитные агенты

агенты

RO

O

O

P

R

RO

X

S

X

O

фосфаты

сульфонаты

RNH

O

R'

O

P

P

R

X

R'NH

X

Амидофосфаты

фосфинаты

R'

P

O

R

O

N

C

RO

X

R'

X

фосфонаты

карбаматы

Рисунок 1.3.-3 иллюстрирует процесс ингибирования и последующего старения НТЭ. Старение представляет собой постингибиторную потерю алкильного фрагмента молекулы ингибитора. В результате образуется аддукт, представляющий собой ковалентно связаную с серином активного центра фермента отрицательно заряженную фосфорильную часть молекулы ингибитора [262-263]. При этом алкильная группа, вероятно, переносится на (Asp1044) или на другие аспартатные остатки в/или около активного центра [240]. Считают, что старение НТЭ является важнейшим событием в инициировани ОНТФОС [285].

Механизм старения НТЭ отличается от старения АХЭ: для НТЭ этот процесс происходит чрезвычайно быстро, в течение нескольких минут, причем быстрее всего стареют структуры с неразветвленными радикалами, в отличие

59

от АХЭ, где старение в целом происходит медленнее, в течение нескольких часов, при этом быстрее стареют структуры с разветвленными алкильными радикалами [285, 286].

O

OR

НТЭ

O

OR

fast

O

O-

NTE

OH + X P

NTE

O

P

NTEНТЭ O P

ОНТФОС

НТЭ

OR

OR

OR

ингибирование НТЭ

старение НТЭ

Рис. 1.3. - 3.Ингибирование и старение НТЭ.

В то же время соединения, в том числе ФОС, ингибирующие НТЭ, но после ингибирования которыми ацилированная НТЭ не способна стареть: фосфинаты, карбаматы, сульфонил фториды – группа Б (Табл. 1.3.- 2), не вызывают ОНТФОС (Рис. 1.3.- 4). Более того, как показано в экспериментах на животных, при введении подобных соединений перед воздействием нейропатичных ФОС, они служат протекторами против отставленной нейротоксичности [79, 190, 265, 287].

O

R

O

нет старения, нет ОНТФОС,

НТЭ

НТЭ

R

защита от нейропатичных ФОС

NTE

OH + X P

R

NTE

O PR

ингибирование НТЭ

Рис. 1.3. - 4.Ингибирование НТЭ неспособным стареть фосфорорганическимингибитором (фосфинатом) и защита от ОНТФОС [223].

«Липидная модель» ОНТФОС

Какие именно процессы приводят к нейродегенерации, и чем обусловлено наличие 2-3 недельного скрытого периода между воздействием отставленного нейротоксиканта и проявлением клинической картины, на данный момент остается неясным. Одной из моделей развития ОНТФОС является так называемая «липидная модель» [226]. Эта модель предполагает, что НТЭ наряду с другими лизофосфолипазами, PLA2 и ацилтрансферазами

60

участвует в регулировании уровня токсичных лизофосфолипидов в мембранах ЭПР. Рисунок 1.3.-5 иллюстрирует предполагаемый механизм «липидной теории».

Рис. 1.3. - 5.Предполагаемый механизм развития аксонопатии согласно«липидной теории » [226], где ОР – ФОС, PLA2 - фосфолипаза А2, LysoPLA – лизофосфолипаза, NTE – НТЭ.

В соответствии с данной моделью нейропатичные ФОС в основном ингибируют НТЭ (а также другие лизофосфолипазы) и ацилтрансферазу.

В результате чего возрастает уровень токсичных лизофосфолипидов в мембране эндоплазматического ретикулума, происходит образование мицелл лизофосфолипида, солюбилизирующих участки мембран, и в итоге – дестабилизация и разрушение мембран. Если подобное повреждение затрагивает достаточно протяженные области мембран ЭПР, можно ожидать развития аксонопатии. При этом нейропатичные ФОС наиболее активны в отношении НТЭ и ацилтрансфераз, а не вызывающие ОНТФОС соединения проявляют избирательность в отношении PLA2.

Из «липидной модели» следует, что определение относительной ингибиторной активности ФОС в отношении PLA2, НТЭ, других лизофосфолипаз и ацилтрансфераз позволяет определить, является соединение нейропатичным или нет [226]. Развитие данной модели требует дополнительного экспериментального подтверждения.

61

Генетический полиморфмзм НТЭ

которые являются подтипом наследственной спастической параплегии человека

(human hereditary spastic paraplegia, HSP) [288, 289]. Клинические проявления данного заболевания имеют сходство с клиникой и патоморфологией ОНТФОС: медленно развивающаяся дегенерация аксонов в периферических нервах и спинном мозге, атрофия мышц и параличи [292].

Показано, что клиническая форма заболевания возникает у людей, имеющих мутации в обоих аллеляхНТЭ. У людей, несущих один аллель дикого типа и второй мутантный аллель (вставка, приводящая к укорочению белка НТЭ), наблюдается низкая активность фермента, но при этом нет клинических признаков NTE-MND [290, 291].

Исследование данных мутаций NTE показало, что нейродегенерация может развиваться как в результате снижения активности NTE, так и при наличии аномальной формы белка.

Ala412Pro вне каталитического сайта НТЭ, возможно, приводит к изменению транскрипционной активности и структуры белка НТЭ.

Было также показано, что пост-трансляционные модификации НТЭ, в том числе фосфорилирование, приводят к усилению токсической функции в результате изменения связывания регуляторных белков с измененной частью молекулы НТЭ [293, 294]. Эта работа подтверждает предположение, что нейродегенерация развивается в результате комбинации двух событий: потери функции нормального белка и усиления токсической функции измененного белка.

Хотя проведенные молекулярно-генетические исследования не раскрывают полностью роль НТЭ в механизме развития ОНТФОС, они

62

однозначно указывают на патологические эффекты, возникающие либо при потере функции белка, либо в результате токсичности мутированного белка. Эти две возможности не являются взаимоисключающими при развитии нейропатий [288, 295].

1.3.4.2. Оценка нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений

Для ФОС, способных стареть, определение ингибиторной активности в отношении НТЭ в опытахin vitro, может быть использовано для оценки их способности вызывать ОНТФОС [264, 296].

Согласно Lotti M. и Johnson M. [296], относительная ингибиторная способность соединений в отношении двух ферментов-мишеней острой (АХЭ)

и отставленной (НТЭ) нейротоксичности - relative inhibitor potency

RIP = IС50(AChE)/IС50(NTE)

(1)

является удобным параметром, характеризующим нейропатичный потенциал соединения. Для необратимых ингибиторов более корректным является кинетический подход к оценке их ингибиторной активности. В связи с этим для оценки нейропатичной опасности соединения предложено использовать отношение бимолекулярных констант ингибирования

НТЭ vs АХЭ [80, 223, 297]

RIP =ki(NTE)/ki(AChE)

(2)

Учитывая, что величина IС50 связана сki, в соответствии с уравнением (3), где t - время предварительной инкубации ингибитора и фермента:

50 = ln 2/(ki× t),

(3)

формула RIP с точки зрения IC50 (1) является вполне корректной.

В связи с тем, что ингибирование сериновых эстераз фосфорорганическими соединениями является время-зависимым процессом, временной интервал предварительной инкубации с ингибитором должен указываться для каждой полученной величины IС50. Многие из значений IС50, описанных в литературе были получены при стандартном 20-минутном

63

интервале предварительной инкубации.

Показано, что относительная способность ФОС или его активного метаболита ингибировать НТЭ по сравнению с АХЭ коррелирует с отношением между величиной LD50 и минимальной нейропатичной дозой (доза, вызывающая атаксию). RIP > 1 указывает на то, что соединение может вызывать ОНТФОС в дозе, меньшей LD50; тогда как величины RIP < 1 свидетельствуют о том, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС, будет больше LD50 [262, 296]. Более того, согласно Johnson M. [262], соединения, для которых RIP 0.05, должны подвергаться тщательному токсикологическому исследованию, т.к. при интоксикации такими соединениями нейропатии могут развиваться после успешного лечения острых отравлений.

1.3.4.3. НТЭ как биомаркер воздействия нейропатичных ФОС

Наличие четкой зависимости между ингибированием / старением НТЭ и последующим развитием ОНТФОС делает возможным использование НТЭ как биомаркера этого заболевания [79, 262, 298]. Стандартным объектом для оценки нейропатичного потенциала ФОС являются взрослые куры [190, 262, 273]. Так, ингибирование НТЭ головного мозга взрослых кур в течение 24 часов после воздействия ФОС, способных стареть, т.е. фосфатов, фосфонатов, амидофосфатов, предсказывает развитие ОНТФОС через 1-3 недели. При этом пороговый уровень ингибирования НТЭ необходимый для проявления клинических признаков ОНТФОС составляет не менее 70%.

В опытах на курах показано, что для характеристики нейропатичной опасности ФОСin vivo применим показатель, основанный на отношении ингибиторной активности соединения в отношении НТЭ и АХЭ мозга и являющийся аналогом RIP [79, 299]: ED50(АХЭ)/ED50(NTE), где ED50 - средняя эффективная доза (мг/кг), при которой активность фермента снижена на 50%. Если величина данного отношения возрастает, то и нейропатичная опасность соединения увеличивается.

64

Как уже отмечалось, для человека характерна высокая чувствительность к действию нейропатичных ФОС [300, 301]. Кроме того, заболевание имеет скрытое начало, и отсутствуют антидоты и средства специфической терапии. Эти факты подчеркивают важность разработки биомаркеров, позволяющих определить сам факт воздействия нейропатичных ФОС на человека и степень этого воздействия для оценки риска возможного развития ОНТФОС.

Хорошо известно, что АХЭ эритроцитов и БХЭ плазмы крови могут быть использованы как биомаркеры воздействия антихолинэстеразных соединений, таких как фосфорорганические инсектициды [302, 303]. Но эритроциты как и плазма крови не содержат НТЭ. Однако было показано наличие активности НТЭ в лимфоцитах [304, 305]. Исследования на животных продемонстрировали хорошую корреляцию между ингибированием лимфоцитарной НТЭ и НТЭ мозга [227, 306-310].

Было показано, что НТЭ периферических лимфоцитов человека может быть использована в качестве биомаркера воздействия на организм нейропатичных ФОС, в частности в образцах крови, взятых в течении 24 часов после воздействия [227, 308, 311-313]. До настоящего времени определение активности НТЭ лимфоцитов было единственным методом мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека [285, 303, 314].

Вместе с тем, использование лимфоцитарной НТЭ для рутинного мониторинга НТЭ у лиц, потенциально подвергнутых воздействию нейропатичных ФОС, весьма затруднено рядом объективных обстоятельств. Прежде всего, это значительный объем проб крови, который необходим для разделения форменных элементов крови; сама процедура разделения и дальнейший анализ трудоемки, требуют значительного времени, материальных ресурсов и квалифицированного персонала. Для мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека, особенно в полевых условиях, было бы чрезвычайно удобно иметь возможность быстрого определения активности НТЭ в маленьких объемах цельной крови. Однако красный цвет крови, а также достаточно низкая активность НТЭ в крови, делали невозможным

65

использование стандартного спектрофотометрического метода измерения [250]. Для создания простого и быстрого метода мониторинга воздействия нейропатичных ФОС на человека нашей лабораторией совместно с кафедрой химической энзимологии МГУ был разработан принципиально новый подход к анализу активности НТЭ с использованием тирозиназных биосенсоров для определения фенола, выделяющегося как продукт ферментативного гидролиза фенилвалерата  в  присутствии  НТЭ  [315,  316].  Использование  высоко-чувствительного амперометрического биосенсора на основе графитовой пасты, содержащей  грибную  тирозиназу,  позволило  проводить  определение активности НТЭ с высокой чувствительностью и селективностью в цельной крови при многократном разбавлении исходного образца [316]. Результаты последующих исследований продемонстрировали, что цельная кровь может быть   использована   в   качестве   надежного   биомаркера   воздействия

нейропатичных ФОС [306, 307, 317].

В настоящее время разработан новый чувствительный планарный биосенсор на основе сочетания технологии трафаретной печати для создания графитовой подложки и технологии LBL (слой-за-слоем) нанесения полиэлектролитов (нанопленок полидиметилдиаллиламмоний хлорид - ПДДА) и грибной тирозиназы [318], который использовался для определения активности НТЭ в настоящей работе.

66

  1. Карбоксилэстераза

  1. Физиологическая функция и локализация КЭ

Карбоксилэстеразы млекопитающих (КЭ, CES, КФ 3.1.1.1.) представляют собой мультигенное семейство ферментов, относящихся к классу сериновых α/β-гидролаз, локализованных в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и цитозоле клеток различных тканей [319-321].

Активность КЭ обнаружена в печени, почках, тонком кишечнике, сердце, мышцах, легких, мозге, половых железах в клетках эпителия носовой и дыхательной полостей, в лейкоцитах и моноцитах, плазме крови [320, 321].

Li B. с соавторами [173] показали, что плазма крови человека в отличие от мыши, крысы, кролика, лошади и кошки не содержит КЭ, незначительная активность КЭ в цельной крови (0.2-0.32 Ед/мл) связана с присутствием фермента в моноцитах [322, 323]. Гидролиз сложноэфирных соединений в крови человека осуществляют бутирилхолинэстераза и параоксоназа плазмы.

Максимальный уровень экспрессии КЭ обнаружен в микросомах печени млекопитающих. Уровень экспрессии и активность ферментов имеет существенные видовые и индивидуальные различия [324-326].

КЭ обладают широкой субстратной специфичностью, гидролизуют самые разные экзогенные и эндогенные соединения, содержащие сложноэфирные и амидные группы, в том числе лекарственные препараты и пролекарства. КЭ относятся к ферментам первой фазы метаболизма ксенобиотиков, участвуя в детоксикации и/или метаболической активации различных токсикантов и канцерогенов. Высокий уровень экспрессии КЭ в эпителиальных клетках большинства органов подтверждает защитную роль данных ферментов.

1.4.2. Изоформы КЭ млекопитающих

Охарактеризованы по крайней мере пять семейств КЭ млекопитающих согласно гомологии аминокислотной последовательности: КЭ-1 - КЭ-5 (CES1-CES5) [327]. Причем, разные изоформы различаются по субстратной

67

специфичности.

Семейство КЭ1 (CES1) включает основные изоформы КЭ, разделенные на восемь подсемейств: CES1А – CES1H, которые экспрессируются и локализованы преимущественно в печени и ассоциированы с мембранами ЭПР

[328, 329].

CES1A подсемейство включает основные формы человеческой КЭ1 и основные изоформы КЭ крыс, собак, кроликов и мышей. CES 1H подсемейство включает гидролазы В и С, которые катализируют гидролиз ацетил-CoA. Члены CES 1G семейства являются секретируемыми белками [321, 330].

Семейство КЭ2 (CES2) включает кишечные изоформы КЭ человека (hCE2), крысы (rCES2), мыши (mCES2), кролика и хомяка, которые экспрессируются в основном в тонком кишечнике [330, 331] и также ассоциированы с мембраной ЭПР.

КЭ3 (CES3) экспрессируется в мозге, печени, трахее, наивысший уровень ее активности наблюдается в толстой кишке. У человека данная изоформа КЭ предположительно является секретируемой или цитоплазматической, не связанной с мембраной ЭПР [327]. Аминокислотная последовательность КЭ3 человека (CES3A1) примерно на 40% идентична КЭ1 и КЭ2, уровень ее экспрессии в печени и желудочно-кишечном тракте крайне низкий по сравнению с КЭ1 и КЭ2 [330-334].

Мышиный CES3-транскрипт локализован в мозжечке. Метаболическая роль КЭ3 еще не вполне исследована, хотя известно, что данная изоформа способна активировать противоопухолевый препарат иринотекан [332].

Miyazaki K. с коллегами [335] выделили семейство КЭ4 (CES4). В результате исследования возможной причины протеинурии у здоровых кошек был обнаружен гликопротеин с молекулярной массой 70 кДа, имеющий КЭ - специфическую последовательность, который являлся основным белком в моче домашних кошек. Белок назван CAUXIN - carboxylesterase-like urinary excreted protein [335, 336].

Семейство КЭ5 (CES5) включает изоферменты с молекулярной массой

68

46.5 кДа, которые имеют структуру, отличную от других семейств КЭ [337-339]. К этому семейству, вероятно, принадлежат некоторые эстеразы из печени мышей [337] и амидогидролазы из печени обезьяны [338].

КЭ6 (CES6) и у человека и у мышей в основном экспрессируется в периферических тканях, включая мозг, легкие, меланоциты, и является секретируемой формой фермента [340, 341]. В мозжечке показан наивысший уровень экспресии данного белка, хотя транскрипты обнаружены во многих отделах мозга, включая гиппокамп, миндалевидные ядра, обонятельную луковицу, кору, продолговатый мозг. CES6 является секретируемой формой КЭ нервной ткани. Распределение CES6 транскриптов в мозге и их наличие в цереброспинальной жидкости говорит о защитной роли этой изоформы КЭ в мозге, участвующей в детоксикации лекарств и ксенобиотиков [341]. Еще в 1993 году Yamada T. с соавторами [342] показали присутствие КЭ в клетках капиллярного эндотелия мозга, что соответствует защитной роли КЭ для нервной системы от токсичных эфиров, возможно, как компонента гемато-энцефалического барьера [319].

Основные изоформы КЭ человека

КЭ человека представлена множественными изоформами. Наиболее распространены и хорошо изучены семейства КЭ1 и КЭ2. Аминокислотные последовательности этих изоформ гомологичны на 48%.

Большинство изоформ КЭ являются гликопротеинами и имеют сайты гликозилирования (КЭ1 имеет только один сайт - в положении Asn79, у КЭ2 имеется 2 сайта - в положении Asn103 и Asn267) [343]. Мономерные субъединицы КЭ1 и КЭ2 имеет молекулярную массу около 60 кДа.

КЭ-1 в основном экспрессируется в печени и минимально в тонком кишечнике [325]. Функциональный белок КЭ1 представлен тримером с молекулярной массой 180 кДа. КЭ1 находится в динамическом равновесии тример-гексамер, связывание различных лигандов на поверхности фермента смещает равновесие в сторону преобладания тримера [344]. КЭ2 экспрессируется в основном в

69

тонком кишечнике, а также в печени и в меньшей степени в почках. В отличие от КЭ1, КЭ2 является мономерным белком (60 кДа) [325].

Субстратная специфичность КЭ

Изоферменты КЭ отличаются по субстратной специфичности: КЭ1 в основном гидролизует эфиры с короткой спиртовой и длинной ацильной группой, КЭ2 – напротив, более специфична к субстратам с длинной спиртовой группой и короткой ацильной частью [325, 343, 345]. КЭ1 в отличие от КЭ2 способна также катализировать реакцию переэтерификации. Так, КЭ1 гидролизует кокаин с образованием бензоилэкгонина и метанола, а КЭ2 – с образованием бензойной кислоты и метилового эфира экгонина [343].

Широкая субстратная специфичность КЭ определяет возможность клетки метаболизировать целый спектр разнообразных эфирных соединений.

Таблица 1.4-1 иллюстрирует предпочтения КЭ1 и КЭ2 в отношении лекарственных препаратов и наркотиков.

Таблица 1.4. - 1.Субстратная специфичность КЭ1и КЭ2[343].

Субстрат

Субстратная специфичность

Кокаин (метиловый эфир)

КЭ1

Меперидин

КЭ1

Метилфенидат

КЭ1

Темокаприл

КЭ1

Осельтамивир (тамифлю)

КЭ1

Кокаин (бензиловый эфир)

КЭ2>>КЭ1

CPT-11

КЭ2>>КЭ1

Героин

КЭ2>>КЭ1

Метилпреднизолон

КЭ2>>КЭ1

КЭ имеют много общих субстратов с БХЭ, включая 4-нитрофенилацетат, 1-нафтилацетат, иринотекан, кокаин и др. Они также имеют общие

70

ингибиторы: диизопропилфторфосфат (ДФФ), iso-OMPA, параоксон, ФОС, крезил салигенин фосфат (CBDP) и др. Основное отличие между ними состоит в том, что БХЭ лучше взаимодействует с положительно заряженными соединениями (экотиофат, VX, бензоилхолин), тогда как КЭ предпочитает нейтральные [346].

Генетический полиморфизм КЭ человека

Генетический полиморфизм КЭ человека был обнаружен недавно в связи с аномальным ответом на применение некоторых лекарственных препаратов [347, 348]. Методом секвенирования ДНК выявлены две мутации в кДНК, по одной в каждом аллелеКЭ1 [348]. Первая мутация, G143E, расположена в оксианионном центре фермента и ведет к потере эстеразной активности. Вторая мутация, Asp260fs (frameshift), приводит к сдвигу рамки считывания, что уменьшает длину фермента и также ведет к потере ферментативной активности. Клиническим последствием потери активности КЭ1 может быть непереносимость (побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы) метилфенидата (Риталин), лекарственное средство из группы психостимуляторов, используемыое в ряде стран для лечения синдрома дефицита внимания и гиперактивности (СДВГ).

Тамифлю (Tamiflu,Oseltamivir) – противовирусное средство, используемое для лечения и профилактики инфекций вируса гриппа А и В и птичьего гриппа, представляет собой пролекарство, которое активируется КЭ1 в печени [349], активный метаболит селективно ингибирует вирусную нейраминидазу. Форма КЭ1 с мутациями G143E и Asp260fs не способна активировать пролекарство Тамифлю, в связи с чем снижается терапевтическая эффективность и переносимость данного препарата.

Трандолаприл (Trandolapril) - ингибитор ангиотензин-превращающего фермента, также является сложноэфирным пролекарством. Его деэтерификацию до активного препарата катализирует КЭ1 в печени. Неактивные мутантные формы КЭ1 (G143E и Asp260fs) не способны

71

катализировать превращение пролекарства в активный метаболит [350], что приводит к неэффективности препарата и нежелательным побочным реакциям у пациентов.

Имидаприл – сложноэфирное пролекарство для лечения повышенного артериального давления, также активируется КЭ1 в печени. SNP в промоторной области генаКЭ1A2 (-816А/С) влияет на чувствительность пациентов к имидаприлу предложительно в результате увеличения транскрипции генаКЭ1 [351].

Обнаружены и другие единичные нуклеотидные полиморфизмы (SNPs) гена КЭ1: -75G/T, -46A/G, -39A/G, -21C/G, -20G/A, -2G/C. Однако эти замены не оказывают заметного влияния на активность КЭ1 [352].

1.4.3. Структура КЭ

Кристаллическая структура КЭ млекопитающих впервые была установлена для фермента сыворотки кролика в 2002 году [353]. В настоящее время установлена кристаллическая структура КЭ1 (Рис. 1.4.-1) человека, ведется активное исследование структуры фермента в комплексе с различными молекулами для более детального понимания роли КЭ в различных биологических процессах, ее субстратной специфичности [344, 354, 355]. Данная информация важна для направленного дизайна и разработки эффективных пролекарств.

Центральный каталитический домен КЭ окружен α/β-слоями и регуляторными областями [343]. Активный центр КЭ содержит высоко консервативную аминокислотную последовательность, характерную для всех сериновых гидролаз, которая включает активный остаток серина. Каталитическая триада КЭ (Ser203- Glu336 - His450) находится на дне канала на глубине около 15 Ǻ от поверхности белка приблизительно в центре молекулы.

[328].

72

Рис. 1.4. - 1.Структура молекулы КЭ1человека из микросом печени

(тример КЭ1) по данным Protein Data Bank in Europe (PDBe) код 1yaj (http://www.ebi.ac.uk).

Канал активного центра КЭ1 выстлан остатками гидрофобных аминокислот, вход в каталитическую щель ограничен альфа-спиралью. Объем активного центра КЭ намного больше (~1300 Ǻ), чем у АХЭ и БХЭ (300 Ǻ и 500 Ǻ, соответствено). Активный центр КЭ имеет два связывающих домена, расположенных по разные стороны от активного Ser-203: один, «маленький и жесткий», другой – «большой и гибкий». Наличие этих двух доменов облегчает распознавание и связывание химически различных субстратов [354]. Жесткий карман прилегает к оксианионному сайту (Gly124 и Gly125) и выстлан гидрофобными остатками. Короткие ацильные цепи могут легко размещаться внутри этого кармана (метильные и этильные, например). Более объемный гибкий карман выстлан неполярными остатками и может принимать крупные или полициклические молекулы, такие как холестерол. Этот сайт прилегает к «боковой двери» («side door»), которая предположительно пропускает небольшие молекулы субстратов и продуктов в активный центр и из него [344,

73

353]. «Side door» отделена от эстеразного сайта четырьмя аминокислотными остатками: Thr252, Val254, Leu388, Met425.

Еще один лиганд-связывающий сайт, называемый Z-сайт, находится также в каталитическом домене на расстоянии 15 Ǻ от эстеразного сайта и участвует в аллостерической регуляции фермента [344, 355].

Таким образом, активный центр КЭ обладает рядом структурных особенностей в сравнении с АХЭ и БХЭ.Так,КЭ не имеет периферическогоанионного сайта (β-анионного сайта), который отвечает за первичное связывание лигандов, определяет попадание субстрата в каталитическую щель

Общая схема гидролиза субстрата в активном центре КЭ и ключевая роль

74

А)Б)

Рис. 1.4. - 2.Предполагаемый механизм действия КЭ[319].Каталитическаятриада (Ser, Glu, His) в тетраэдрическом интермедиате стабилизируется водородными связями: А) нуклеофильная атака Ser203; Б) образование тетраэдрического интермедиата.

Изоформы КЭ, которые являются внутриклеточными ферментами, связанными с мембраной ЭПР, имеют высококонсервативную С-концевую последовательность HXEL–COOH (в соответствии буквенному коду аминокислот –His-Х-Glu-Leu-, где Х - любая аминокислота), отвечающую за удержание белка на внутренней стороне мембраны эндоплазматического ретикулума посредством связывания с мембранным рецептором KDEL - интегральный мембранный белок сKDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) сигнальной последовательностью на С-конце [343]. На Рисунке 1.4.-2 схематично показана локализация молекулы КЭ на внутренней стороне мембраны ЭПР

[319].

Секретируемые формы КЭ, например, КЭ плазмы крови мыши (ES1) и крысы (Ces1G2), которые экспрессируются в печени, имеют нарушенный вариант удерживающей сигнальной последовательности - HTEHK –COOH (His-Thr-Glu-His-Lys), которая не может связываться с KDEL-рецептором

75

мембраны ЭПР, в связи с чем данные изоформы КЭ секретируются в кровь

[359-359].

КЭ плазмы мышей ( ES1) – гликопротеин 70 кДа, продукт генаES1, локализованного на хромосоме 8, один из 16 гомологичных генов КЭ. Фермент транскрибируется в основном в печени и секретируется в кровь. ES1 обнаруживается в крови и лимфе в основном в форме мономера. Обычно содержание ES1 в крови мышей составляет 80 мг на литр крови, примерно 1.2

мкМ [360].

ES1 взаимодействует с ФОС как биоскэвенджер, стехиометрически связывая и инактивируя ФОС вне зависимости от токсичности соединения. Таким образом ES1 эффективно понижает количество молекул ФОС, способных ингибировать биологически значимые мишени (АХЭ и НТЭ) и повышает устойчивость к токсичным ФОС [361]. Ранее на крысах было показано, что именно КЭ плазмы, а не печени, тонкого кишечника и других органов ингибируется токсичными дозами зомана [362-364]. В недавних исследованиях на модели нокаутных мышей по генуES1 было подтверждено, что именно КЭ плазмы обеспечивает эффективную защиту от высокотоксичных ФОС [360].

У человека отсутствует подобная секретируемая форма фермента, что объясняет отсутствие КЭ в плазме крови человека [173].

Таким образом, активность КЭ в плазме грызунов следует учитывать при использовании их в качестве модельных животных в исследованиях по оценке токсичности соединений во избежание ложной интерпретации данных.

Исследования фармакологически важных препаратов, в том числе доклинические испытания, также проводятся на грызунах. Препараты со сложноэфирными или амидными группировками быстро гидролизуются в плазме грызунов под действием КЭ плазмы, что снижает их эффективную концентрацию и создает определенные затруднения как при изучении фармакологических свойств новых соединений, так и при токсикологических исследованиях. Это также осложняет экстраполяцию результатов, полученных

76

в экспериментах на грызунах, на человека [361, 365]. В связи с этим весьма актуальным является поиск соединений, которые могли бы селективно и длительно ингибировать КЭ плазмы грызуновin vitro иin vivo. Применение таких ингибиторов позволит создать адекватную модель на грызунах для доклинических исследований соединений, подвергающихся карбоксил-эстеразному гидролизу [365].

1.4.4. Биологическая роль КЭ

КЭ относятся к ферментам первой фазы метаболизма ксенобиотиков: гидролизуют разнообразные липофильные химические соединения, содержащие сложноэфирную и амидную связь, до соответствующих водорастворимых свободных кислот и спиртов или аминов, тем самым, способствуя их элиминированию [320, 366, 367].

1.4.4.1. Роль КЭ в метаболизме лекарственных препаратов

Поскольку сложноэфирные производные многих терапевтических агентов используются в качестве пролекарств, с медицинской точки зрения КЭ являются основными факторами, определяющими фармакокинетику и фармакодинамику большинства подобных соединений, превращая их в активные лекарственные формы [319, 368].

Генетический полиморфизм, различные заболевания, лекарственные взаимодействия и ксенобиотики могут быть причиной изменения активности КЭ у индивидуума, меняя, таким образом, терапевтическую эффективность лекарственных препаратов - субстратов КЭ [351, 368-370].

КЭ1 активируют такие пролекарства как ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (темокаприл, цилазаприл, квинаприла и имидаприла) [351, 371, 372]. Перспективные противоопухолевые препараты иринотекан (CPT-11, Irinotecan) и капецитабин активируются в организме в основном под дейстием КЭ2 [370, 373-376].

77

КЭ гидролизуют наркотики (кокаин, героин) [181, 378, 379] и препараты, действующие на ЦНС (метилфенидат, меперидин (петидин), флумазенил и др.) [380, 381], а также антиагреганты (клопидогрел, дабигатрана этексилат, аспирин и др), статины (симвастатин, ловастатин, клофибрат и др), противовирусные средства (осельтамивир - Тамифлю), тенофовир дизопроксил, валацикловир и др.), иммунодепрессанты (метилпреднизолон сукцинат) [368].

Таким образом, активность КЭ является важным параметром в фармакокинетике большинства терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку, причем конструирование многих новых лекарств идет с учетом их метаболической активации или инактивации за счет карбоксилэстеразного гидролиза [382]. В связи с этим, ингибиторы КЭ, влияющие на скорость гидролиза подобных лекарственных препаратов, и таким образом определяющие скорость превращения пролекарства в действующее лекарство или, наоборот, увеличивающие полупериод жизни активного препарата, гидролизующегося КЭ, имеют важное терапевтическое значение

[383, 384].

Селективные ингибиторы КЭ востребованы также в качестве вспомогательного инструмента в доклинических исследованиях на грызунах новых фармакологических препаратов со сложноэфирными и амидными группировками, поскольку грызуны в отличие от человека имеют высокую активность КЭ плазмы [361, 365, 385, 386].

1.4.4.2. Роль КЭ в метаболизме липидов

Помимо основной роли КЭ в метаболизме ксенобиотиков недавние исследования выявили ее роль в метаболизме липидов [387-389]. Показано, что КЭ1 человека и ее мышиный ортолог Ces3 отвечают за мобилизацию цитозольного пула триглицеридов (ТГ) и их последующую сборку в липопротеины очень низкой плотности, которые впоследствии выходят из гепатоцитов в кровоток [390]. Кроме того, КЭ частично контролирует липолиз ТГ в жировой ткани мышей [391]. отсутствие такой регуляции приводит к

78

высокому уровню жирных кислот в крови, липотоксичности и к клиническим проявлениям сахарного диабета. Гидролазная активность КЭ1 в отношении эфиров холестерина может предотвращать их накапливание в макрофагах человека и таким образом снижать риск развития атеросклероза и метаболического синдрома [392, 393].

1.4.4.3. Взаимодействие с ФОС: роль КЭ как биоскэвенджера и биомаркера воздействия ФОС

Одна из важнейших биологических функций КЭ - участие в детоксикации фосфорорганических соединений. Рассматривают два основных механизма защитного действия этих ферментов. Первый – это гидролиз карбоксиэфирной связи в тех ФОС, где она присутствует – это показано, например для малатиона [394], ацетиона и ряда других соединений [395]. Второй, более общий механизм, это ингибирование КЭ фосфорорганическими соединениями, приводящее к снижению концентрации антихолинэстеразного агента в циркулирующей крови и, соответственно, к меньшей степени ингибирования АХЭ и НТЭ в тканях-мишенях [396]. Таким образом, КЭ играет роль стехиометрической ловушки – скэвенджера, подобно БХЭ. Показано, что фосфорилированная КЭ плазмы в отличие от БХЭ подвергается быстрой спонтанной реактивации с образованием нетоксичных и неактивных метаболитов ФОС [365]. КЭ1 способна восстанавливать свою активность даже после ингибирования зарином [95]. Эти факты позволяют рассматривать КЭ1 в качестве эффективного биологического скэвенджера, который бы мог служить в качестве профилактического средства при отравлениях ФОС [95], а также для детоксикации оборудования и строений после воздействия ФОС [397].

Однако, в крови и плазме человека уровень активности КЭ чрезвычайно низок в противоположность стандартным лабораторным животным (мышам, крысам, кроликам), которые имеют высокий уровень КЭ в плазме [173, 386]. Это предполагает незначительную роль КЭ крови человека в качестве ФОС-скэвенждера, и соответственно низкую роль КЭ крови человека в качестве

79

биомаркера, в противоположность КЭ крови грызунов и других животных. Данный факт необходимо учитывать при токсикологических исследованиях, проводимых на животных моделях.

КЭ гидролизуют и таким образом детоксицируют пиретроидные пестициды.Высокая активность КЭ насекомых-одна из причин ихустойчивости к фосфорорганическим инсектицидам и снижения эффективности пиретроидов. Совместное применение ингибиторов КЭ позволяет преодолеть резистентность и усилить инсектицидное действие как фосфорорганических, так и пиретроидных инсектицидов [398].

Таким образом, токсичность и терапевтический эффект целого спектра соединений зависят от активности КЭ. В связи с этим оценка уровня активности КЭ очень важна при использовании лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирные группировки, перспективной антираковой терапии, а также для защиты организма от токсического действия ФОС.

80

1.5. Параоксоназа

Другой важной группой эстераз являются параоксоназы (PON). PON широко распространены у млекопитающих, включая человека. PON-подобные белки обнаружены у различных классов организмов, включая бактерии и грибы, что говорит о филогенетической древности этой группы ферментов. PON не относятся к классу сериновых эстераз, каталитический центр PON содержит «гистидиновую диаду», в отличие от АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, имеющих высококонсервативную каталитическую триаду, в состав которой входит активный остаток серина.

Параоксоназы относятся к классу А-эстераз: ФОС не ингибируют данные ферменты, а являются их субстратами, в отличие от B-эстераз (АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ), которые являются мишенями ФОС [69].

1.5.1. Локализация и субстратная специфичность PON

Параоксоназы человека разделены на три подсемейства (PON1, PON2 и PON3), гены которых картированы на длинном плече хромосомы 7 человека в локусе 7q21.3, рядом с геномАХЭ(7q22). Аминокислотные последовательности изоформ идентичны на 60-70% [399].

PON1 имеет два номера по классификации ферментов, поскольку гидролизует нитрофенилацетат (арилэстераза, КФ 3.1.1.2) и триэфир фосфорной кислоты - параоксон (арилдиалкилфосфатаза, фосфотриэстераза, органофосфатгидролаза, КФ 3.1.8.1).

У млекопитающих все три гена PON высоко консервативны и демонстрируют 79-95% идентичности на аминокислотном уровне и 81-95% на уровне нуклеотидов для различных генов [399, 400], что говорит об их важной физиологической роли.

PON1 изначально была идентифицирована как фермент, способный гидролизовать параоксон, первый и один из наиболее изученных субстратов. Впоследствии это название закрепилось за всем семейством ферментов. Однако

81

только PON1 обладает значительной параоксоназной активностью, PON3 имеет очень низкую параоксоназную активность, а PON2 не обладает ею вообще [401], при этом все три изоформы обладают в той или иной степени арилэстеразной и лактоназной активностью. Название фермента дает ошибочное представление, будто параоксон является лучшим субстратом для фермента, на самом деле PON1 гидролизует фенилацетат (наилучший известный субстрат PON1) в 1000 раз быстрее, чем параоксон [402].

Все три изофермента PON1 обладают лактоназной активностью и участвуют в гидролизе некоторых общих субстратов – ароматических лактонов, но также обладают и собственной субстратной специфичностью. Все три параоксоназы очень эффективно взаимодействуют с производными арахидоновой и докосагексаеновой кислот, являющимися эндогенными субстратами ферментов семейства PON [403].

PON1 главным образом экспрессируется в печени и секретируется в кровь, в плазме крови она прочно связана с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП). Показано, что ферментативная активность и стабильность молекулы PON1 зависят от связи фермента с частицами ЛПВП [151, 406-408].

Концентрация белка PON1 в плазме человека составляет примерно 60 мг/л

[410].

82

Очень высокий уровень активности параоксоназы присутствует в печени и плазме крови грызунов, причем в плазме содержится более 50% всей параоксоназы [411].

1.5.2. Структура PON1

PON1 имеет молекулярную массу 43 кДа и состоит из 353 аминокислотных остатков. Остатки Cys42 и Cys353 образуют дисульфидный мостик, который связывает N- и C-концевые области молекулы, свободный Cys284 необходим для проявления лактоназной активности фермента, но не участвует в арилэстеразном и параоксоназном гидролизе [412], [413].

Кристаллическая структура PON1 представлена шестьюβ-слоями, организованными в виде пропеллера (Рис. 1.5.-1). В центральной части молекулы имеется канал, внутри которого располагается активный центр. Помимоβ-складок, в молекуле имеется триα-спиральных домена, два из которых ограничивают вход в центральный канал и играют роль своеобразного якоря для закрепления молекулы фермента на поверхности частиц ЛПВП [410, 414].

Ca2+Ca2+

Рис. 1.5. - 1.Кристаллическая структураPON1по даннымPDBкод1v04

(http://www.ebi.ac.uk).

83

PON1 является Ca2+- зависимой гидролазой: внутри центрального канала фермента располагаются два иона Ca2+, один из которых участвует в стабилизации структуры белка, другой необходим для каталитической функции PON1. ЭДТА полностью ингибирует активность фермента [410]. Ион кальция необходим как для гидролиза лактонов, так и для параоксоназной и арилэстеразной активностей PON1 [414]. Необходимость именно Ca2+ доказывалась его заменой на ионы цинка или магния: ферментативная активность со всеми субстратами сильно снижалась в присутствии Zn2+ и Mg2+ (приблизительно в 10-100 раз) [410, 414].

В активном центре фермента располагается «гистидиновая диада» - сопряженный комплекс остатков His115 и His134, участвующих в эстеразном и лактоназном гидролизе, но не в фосфотриэстеразной активности [415]. Структура активного центра указывает на общеосновный механизм катализа: His115 депротонирует молекулу воды, образующийся гидроксильный радикал атакует молекулу субстрата и вызывает ее гидролиз. His134 является донором протона, повышая основность His115. «Каталитический» ион Ca2+ стабилизирует образующийся отрицательно заряженный интермедиат. Ацил-ферментный комплекс в процессе гидролиза, по всей видимости, не образуется [416]. Аминокислотныеостатки, обусловливающие фосфотриэстеразную активность и эстеразную/лактоназную активность PON1 находятся в разных областях активного центра [415, 416].

1.5.3. Физиологическая функция PON1

Физиологической функцией PON1 предположительно является гидролиз гомоцистеин-тиолактонов, что предотвращает гомоцистеинилирование белков и предупреждает развитие атеросклероза [417, 418]. PON1 гидролизует и другие эндогенные лактоны, например, лактон гомогентизиновой кислоты, промежуточный продукт распада циклических аминокислот – фенилаланина и тирозина [413].

Как уже отмечалось, PON1 синтезируется главным образом в печени и

84

секретируется в кровь, где она связывается с ЛПВП. Одной из естественных физиологических функций PON1 является метаболизм токсичных окисленных липидов и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), а также ЛПВП, что снижает риск развития атеросклероза [419-424].

Активность PON1 понижена при ряде патологий, ассоциированных с атеросклерозом. Наблюдается обратная зависимость между уровнем активности PON1 и риском развития сердечно-сосудистых заболеваний [413, 425, 426], что свидетельствует о важном клиническом значении этого фермента

[421, 427].

PON1 способна также гидролизовать фактор активации тромбоцитов (PAF), что значительно снижает тромбообразование и хемотаксис лейкоцитов

[428].

1.5.4. Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств

PON1 играет важную роль в гидролитическом метаболизме некоторых лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирную и лактоновую группировку [403]. Так, PON1 гидролизует ловастатин, используемый для контроля уровня холестерина. [413].

Ингаляционная терапия кортикостероидами для лечении астмы предполагает устойчивость данных препаратов в легких, но при этом их быструю инактивацию при попадании в кровь во избежание побочных эффектов. Было показано, что именно лактоны, но не эфиры кортикостероидов обладают должным эффектом [429]. Их инактивация в крови обеспечивается PON1, тогда как в легких PON1 отсутствует.

1.5.5. PON1 и детоксикация ФОС

PON1 играет ключевую роль в детоксикации ряда ФОС, гидролизуя их активные метаболиты (оксоны), что показано в исследованиях на животных моделях [430, 431]. PON1 гидролизует оксоны ряда фосфорорганических инсектицидов (например, параоксон, хлорпирифос–оксон, диазинон-оксон,

85

пиримифос-метилоксон), а также нервно-паралитические боевые отравляющие вещества, такие как зарин, зоман, табун и в меньшей степени VX [410]. Данные, полученные на животных моделях [432, 433], убедительно показали основную роль параоксоназ в детоксикации тионфосфорильных ФОС, метаболизм которых идет по пути Р450 / PON1.

Живые организмы с низким уровнем параоксоназы (например, птицы) более восприимчивы к специфическим фосфорорганическим соединениям, чем животные с высоким уровнем активности этого фермента (например, крысы, мыши и в особенности кролики) [400, 433, 434]. Гидролизуя ФОС, PON1 тем самым нейтрализует их токсическое действие на организм. Однако параоксоназная активность фермента в крови человека относительно невысока

[410, 434, 436]

Возраст является существенным фактором, определяющим активность PON1. Исследования на грызунах показали, что в печени и сыворотке крови у новорожденных животных наблюдается очень низкий уровень активности PON1, который увеличивается до нормального уровня к 21 дню жизни [437, 438]. Низкий уровень активности параоксоназы у молодых животных частично объясняет наблюдаемую у них более высокую чувствительность к ФОС [434,

437, 439, 440].

Низкая активность PON1 в процессе вынашивания плода может представлять собой фактор риска повышения восприимчивости к токсическому действию некоторых фосфорорганических инсектицидов. У детей до двух лет наблюдается минимальная активность PON1, и только к 9 годам ее активность достигает уровня активности у взрослых людей [441, 442]

86

стресса при старении, и имеет влияние на повышение риска заболеваемости атеросклерозом у пожилых людей [443]. В связи с пониженным уровнем активности PON1 в детском и пожилом возрасте эти категории людей более восприимчивы к токсическому воздействию ФОС [441].

  1. Генетический полиморфмзм PON1

Определяющее значение имеют два наиболее распространенных полиморфизма в кодирующей области гена: L55M (Leu/Met) и Q192R (Gln/Arg) [444], которые оказывают влияние на каталитическую активность параоксоназы [444-447]. Частота встречаемости Leu55 и Met55 составляет, соответственно, 0.65 и 0.35 в Соединенных Штатах и Европе, тогда как в Японии 0.94 и 0.06, соответственно [448, 449]. Вариант Leu55 имеет более высокую активность в отношении гидролиза фенилацетата, чем Met55 [450]. Замена Gln192Arg (Q192R), определяет различную каталитическую активность PON1 в отношении некоторых фосфорорганических субстратов и повышенную склонность к ишемической болезни сердца и смертности среди женщин во второй половине жизни [451]. Встречаемость Q192 варьирует в диапазоне от

  1. для кавказской популяции до 0.3 для некоторых азиатских популяций [452]. Примерно в 98% случаев вариант аллеля R192 связан с вариантом L55. Было показано, что R192-форма белка быстрее гидролизует параоксон, чем Q192-форма, тогда как для зарина, зомана, диазоксона наблюдается обратная катртина.

T-108C представляет собой полиморфизм тимидин/цитозин в промоторной области гена PON1, следствием которого является значительная вариабельность концентрации РON1 [433, 449, 450]. C-108T полиморфизм оказывает наибольший эффект на уровень PON1 в плазме, причем для -108C аллеля уровень активности PON1 в плазме вдвое превышает таковой для -108T

87

аллеля. Эти генетические факторы в значительной мере определяют индивидуальную чувствительность к ФОС, понижая как активность фермента, так и его содержание в крови [419, 436, 441].

Важность статуса PON1 для оценки восприимчивости организма к токсичным веществам или риска развития сердечно-сосудистых заболеваний указывает и на значимость факторов, влияющих на активность PON1. Хотя генетические факторы, такие как полиморфизм, о котором было сказано ранее, играют главную роль в определении PON1-статуса человека, вклад других факторов в регуляцию деятельности фермента также имеет значение. Так, показана модуляция экспрессии генаPON1 у человека широким спектром соединений: статины, желчные кислоты, этанол [453], полифенолы, флавоноиды, антиоксиданты, ацетилсалициловая кислота. Также оказывают влияние факторы окружающей среды (активные формы кислорода и азота, табачный дым [454], тяжелые металлы). Атерогенная диета и воспалительные процессы также способны влиять на уровень экспресии гена PON1 [408, 419].

Таким образом, в организме PON1 выполняет

В связи с этим уровень активности PON1 в крови является важным показателем как для предсказания индивидуальной чувствительности к действию ФОС, так и для оценки риска кардиоваскулярных заболеваний, а также при проведении экспериментальных исследований в токсикологии и фармакологии.

88

***

Обзор литературных источников показал, что АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 играют важнейшую роль в организме человека и могут служить индикаторами различных патологических состояний, в том числе и вызванных контактами с токсичными ФОС и карбаматами. Показана важная роль ингибиторов АХЭ, БХЭ и КЭ как фармакологических препаратов. Отмечена значимость анализа активности указанных эстераз для своевременной диагностики и подбора индивидуальной лекарственной терапии в клинической практике и токсикологии.

89

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

  1. Материалы

кислота (ДТНБ), трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид (Трис), феррицианид калия (K3[Fe(CN)6]), этилендиаминтетрауксусная кислота

(ЭДТА), протеин стандарт (бычий сывороточный альбумин (BSA), хлорид кальция (CaCl2); диметилсульфоксид (DMSO), этопропазин (ЭПр), 1-нафтилацетат (1-NA), 4-нитрофенилацетат (4-NPA), фенилацетат (PhA), эзерин, диэтил-4-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты (параоксон, РО), тетра(моноизопропил)пирофосфотетрамид (iso-OMPA), бис-пара-нитро-фенилфосфат (BNPP) фирмы Sigma-Aldrich (США); 4-аминоантипирин (4-ААП) (Acros organics, Бельгия); фенилвалерат (PhV) и мипафокс (МХ) (Oryza Laboratory Inc., США), цитрат натрия (Merck, Германия).

О-фосфорилированные гексафторизопропанолы (PFP):O,O-диэтил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (diEt-PFP) иO,O-дибутил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил)фосфат (diBu-PFP); серияO,O-диалкил-O-(1-этоксикарбонил-2,2,2-трифторэтил) фосфатов (O-фосфорилированных этилтрифторлактатов, TFL) иO,O-ди-1-пропил-О-2,2-дихлорвинилфосфат (diPr-DClVP) синтезированы и предоставлены зав. лаб. синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН к.х.н. Соколовым В.Б. и в.н.с., к.х.н. Аксиненко А.Ю. Синтез diEt-PFP и diBu-PFP проводился по методу, описанному в работах [64, 455, 456], TFL синтезированы по методу, описанному в работе [64, 456].

Все остальные реактивы были марки не ниже Х.Ч. и использовались без

предварительнойочистки.Всеводныерастворыготовилисьв

90

бидистиллированной воде.

2.2. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями

Определение бимолекулярных констант ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми ФОС (ki, М-1мин-1) проводили с использованием коммерческих препаратов ферментов фирмы Sigma-Aldrich (США) - ацетилхолинэстеразы (АХЭ, Е.С. 3.1.1.7) эритроцитов человека (500 Ед/мг, C0663), бутирилхолинэстеразы (БХЭ, Е.С. 3.1.18) сыворотки крови лошади (500 Ед/мг, (C4290)), карбоксилэстеразы (КЭ, E.C. 3.1.1.1.) печени свиньи (150 Ед/мг, (E2884)); и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории и детально описанной в работах [457, 458]. ЛиоНТЭ - это мембранная (Р2 + Р3) фракция гомогената головного мозга кур, предварительно обработанная параоксоном (40 мкМ, 40 мин), которая представляет собой параоксон-резистентную эстеразную активность мозга.

Для кинетических исследований использовали 3-4 концентрации ингибитора (~ 0.5× IC50, М; 1×IC50, М и 2×IC50, М) и для каждой концентрации 4-5 различных интервалов времени инкубации. Ферменты инкубировали с исследуемыми соединениями в соответствующем рабочем буфере в условиях [I]0>>[E]0 при 25°C для АХЭ, БХЭ, КЭ и при 37°C для НТЭ. Конечная концентрация растворителя (ацетон) составляла не более 1% об/об. В отдельных экспериментах нами было показано, что в данной концентрации ацетон не оказывает значимого влияния на активность ферментов. Запасные растворы ингибиторов готовили непосредственно перед проведением экспериментов. Контрольные пробы содержали соответствующий объем растворителя без ингибитора.

Остаточную активность АХЭ и БХЭ определяли методом Эллмана [459] с 1 мM ацетилтиохолином (АТХ) и 1 мM бутирилтиохолином (БТХ) в качестве

91

субстратов, соответственно, в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 7.5 при 25oC, λ=412 нм, (ɛ412 = 14150 M-1 cm-1) в присутствии 0.33 мМ ДТНБ.

Активность КЭ определяли с использованием 1 мM 4-NPA в качестве субстрата в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 8.0 при 25o, λ=405 нм (ɛ405 = 13300 M-1cm-1).

Активность НТЭ определяли как разность между параоксон-резистентной (ЛиоНТЭ) и (параоксон+мипафокс)-резистентной (ЛиоНТЭ + мипафокс 250 мкМ, 20 мин) эстеразной активностью в соответствии с дифференциальным методом Johnson M.K. (1977) [250]. Реакцию проводили в 50 мМ трис-HCl буфере рН 8.0 с 0.2 мМ ЭДТА при 37°C, субстрат - 1.4 мМ фенилвалерат. Выделяющийся в результате реакции фенол определяли при λ = 510 нм (ɛ510 = 13900 M-1 min-1). Измерения проводили на микропланшетном спектрофотометре

Bio-Rad Benchmark Plus (France) в 96-и луночных планшетах.

Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ и КЭ

Контрольная проба без ингибитора содержала 10 мкл 5% раствора ацетона в соответствующем рабочем буфере и 40 мкл раствора фермента в буфере.

Опытная проба содержала 10 мкл раствора ингибитора определенной концентрации и 40 мкл раствора соответствующего фермента. Реакцию ингибирования начинали внесением фермента. Реакционную смесь инкубировали при 25°C в течение 1, 2, 4, 6 мин для максимальной концентрации ингибитора; в течение 2, 4, 6, 8 мин для средней концентрации и в течение 3, 6, 9, 12 мин для минимальной концентрации ингибитора. Реакцию ингибирования АХЭ и БХЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (АТХ и БТХ соответственно) в рабочем буфере, содержащем 0.33 мМ ДТНБ (общий объем вносимого раствора 200 мкл). Реакцию ингибирования КЭ останавливали внесением 1.25 мМ раствора субстрата (4-NPA) в 200 мкл рабочего буфера. Суммарный объем реакционной смеси составлял 250 мкл.

92

Исследование кинетики ингибирования НТЭ

Перед экспериментом лиофилизованный препарат НТЭ, хранящийся в стеклянных запаянных ампулах при –70oC, ресуспендировали в гомогенизаторе Поттера (тефлон : стекло) в 5 мл рабочего буфера. Определение активности проводили через 0.5-1 ч, концентрация белка в препарате составляла 0.1-0.14 мг/мл (Bradford M.M., 1976). Субстрат фенилвалерат готовили непосредственно перед проведением эксперимента: запасной раствор фенилвалерата в этаноле 15 мг/мл (84 мМ) разбавляли в 30 раз 0.03% водным раствором Тритона Х-100, тщательно перемешивая для получения эмульсии, и получали рабочую концентрацию фенилвалерата - 2.8 мМ. Запасной раствор мипафокса (12.5 мМ) готовили в 50 мМ Трис-цитратном буфере, рН 6.0.

Исходную активность препарата ЛиоНТЭ (V0) определяли как разницу между РО-резистентной фенилвалерат-гидролизирующей активностью (VPO) - проба 1 (0.855 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя (ацетон) и 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ, объем смеси 1 мл) и (РО+МХ)-резистентной активностью (VPO+MX) - проба 2 (0.835 мл рабочего буфера, 0.02 мл растворителя, 0.02 мл 12.5 мМ раствора МХ (250 мкМ конечная концентрация), 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ, объем смеси 1 мл). Добавлять PO в пробы не требуется, поскольку при получении препарата ЛиоНТЭ (P2+P3) фракция гомогената мозга уже была обработана PO. Инкубацию с МХ начинали внесением 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ. Время инкубации - 20 мин при 370C. Реакцию ингибирования останавливали внесением избытка субстрата – эмульсии фенилвалерата (1 мл 2.8 мМ, конечная концентрация 1.4 мМ). Через 20 мин реакцию гидролиза субстрата останавливали внесением 1 мл раствора: 1% (в/об) SDS + 0.025% (в/об) 4-AAP. Через 5 минут добавляли 0.5 мл 0.4 % (в/об) водного раствора K3[Fe(CN)6], в результате чего развивается окраска, интенсивность которой детектировали на микропланшетном спектрофотометре Bio-Rad Benchmark Plus при длине волны 510 нм. Все измерения проводили в трипликате. Разница между значениями оптической плотности пробы 1 и пробы 2 соответствует активности НТЭ (V0 = VPO - VPO+MX). Активность препарата ЛиоНТЭ составляла

93

45 ± 5 нмоль/(мин×мг белка).

Ингибирование ЛиоНТЭ исследуемыми ФОС проводили в аналогичных условиях, но вместо растворителя в пробу 1 вносили 0.02 мл раствора ингибитора соответствующей концентрации. Реакцию ингибирования начинали внесением 0.125 мл препарата ЛиоНТЭ и останавливали внесением избытка субстрата через выбранные промежутки времени для каждой концентрации ингибитора. Для максимальной концентрации ингибиторов время инкубации с препаратом ЛиоНТЭ составляло 5, 10, 15, 20 мин; для средней концентрации - 5, 10, 20, 30 мин и для минимальной концентрации ингибиторов - 10, 20, 30, 40 мин.

Величины бимолекулярных констант ингибирования эстераз исследуемыми

ФОС (ki, М-1мин-1)определяли в соответствии с классической работой[69].В случае, если кинетика ингибирования фермента описывалась схемой

ki

E

+

I

EI

(E  -  фермент,  I

ингибитор),

тангенс  угла  наклона  прямых  в

полулогарифмических координатах lg(V0/Vt) =f(t) (Рис. 2.2. – 1), соответствующий константе скорости псевдопервого порядкаk′ = 2.303×tgα, пропорционален концентрации ингибитора. В этом случае бимолекулярную константу ингибирования (ki, М-1 мин-1) определяли в соответствии с уравнениемki = 2.3×lg(V0/Vt)/([I]×t). В результате анализа графических зависимостей, построенных в полулогарифмических координатах по уравнению: lg(V0/Vt) = (ki ×[I]/2.3) × t (Рис. 2.2. – 1), определяли константу скорости псевдопервого порядка для каждой концентрации ингибитора (M-1)

k′ = 2.303×tgα = ki×[I],а затем бимолекулярную константу ингибирования

-1мин-1)ki = 2.303× tgβ (Рис. 2.2.-2).

94

0.7

[I]3

0.09

0.6

0.08

0.07

0.5

[I]2

)

0.06

Vt

0.4

0.05

( Vo /

αtg

0.3

0.04

lg

0.2

[I]1

0.03

0.1

tgα

0.02

0.01

0.0

0.00

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

t, мин

tgβ

0.5

1

2

3

4

5

концентрация ингибитора [I], М

Рис. 2.2. 1.Зависимость степени

Рис. 2.2. 2.Типичный график

ингибирования фермента различными

зависимости величин k′ от

концентрациями ингибитора от времени.

концентрации ингибитора,

V0 – активность фермента в отсутствие

ki = 2.303 × tgβ.

ингибитора, Vt – остаточная активность

фермента при данном времени инкубации с

ингибитором; [I]1 < [I]2 < [I]3

Если кинетика ингибирования фермента описывалась схемой

k+1

k+2

E  +  I

EI

EI

k-1

Ka=

k-1+ k+2

k-1

ki= k+2/Ka,

k+1

k+1

(E - фермент, I – ингибитор,Ka – константа Михаэлиса,k+2 – константа фосфорилирования), типичные графики зависимости степени ингибирования фермента lg(V0/Vt) от времени инкубации (t) с возрастающими концентрациями ингибитора имеют вид, представленный на Рисунке 2.2.- 3.

0.8

[I]4

[I]3

[I]2

0.7

[I]1

)

0.6

/ Vt

0.5

Vo

0.4

lg (

tgα

0.3

0.2

0.1

0.00

5

10

15

20

25

30

35

40

t, мин

95

2.0x10-6

1.6x10-6

1.2x10-6

k'/

tgβ′ = 1/k+2

I[]

8.0x10-7

4.0x10-7

1/ki

0.0

4

6

8

10

2

концентрация ингибитора, [I] М

Рис. 2.2. 3.Зависимость степени ингибированияРис. 2.2. 4.Типичный график

активности фермента различными концентрациямизависимости величин [I] / k′ от

ингибитора от времени. V0 – активность ферментаконцентрации ингибитора, где

в отсутствие ингибитора, Vt – остаточнаяk′ = 2.303 × tgα.

активность фермента при данном времени

инкубации с ингибитором; [I]1 < [I]2 < [I]3 < [I]4.

При данной схеме ингибирования не наблюдается пропорциональности в зависимости константы скорости псевдопервого порядка (k′ = 2.303 × tgα) от концентрации ингибитора. Построение зависимостей в координатах [I]/2.3tgα =f[I]позволяло получить линейную зависимость(Рис. 2.2.-4)в соответствии суравнением [I]/k′ = Ka/k+2 + [I]/k+2, из которого определяли индивидуальные кинетические параметры процесса – константу Михаэлиса (Ka, M) и константу фосфорилирования (k+2, мин-1).

Анализ данных и вычисление кинетических констант (ki, M-1мин-1) проводили с использованием программы Origin 6.1.

2.3. QSAR анализ эстеразного профиля соединений

Эстеразный

профиль

соединений

анализировали

методом

количественного анализа связи структура–ингибиторная активность и структура–ингибиторная селективность (QSAR) с построением моделей Хэнча [460]. Cвязь между структурой и антиферментативной

96

активностью/селективностью соединений анализировали методом множественной линейной регрессии с использованием функции Регрессия программы Excel MSWin XP. Мы исп ользовали модели «гидрофобность - ингибиторная активность» типа Хэнча с включением в них стерических факторов. В качестве физико-химических дескрипторов использовали константы гидрофобности Хэнча (πCH2 = 0.5) и стерические константы заместителей Чартона (Evs ) для алкильныхΣEvs(R) и алкоксильныхΣEvs (RO) заместителей [460]. Значимость полученных корреляционных уравнений оценивали по величинеr – коэффициента множественной корреляции,s – стандартного отклонения,F – секвенциального критерия Фишера иР – уровня значимости критерия Фишера.

Для каждого фермента были построены следующие модели Хэнча [460] структура–ингибиторная активность и структура– ингибиторная селективность, из которых выбирались наилучшие уравнения в соответствии с их статистическими показателями.

lg (активность или селективность) = A + B∑π

lg (активность или селективность) = A + B∑π + DΣEvs (RO) lg (активность или селективность) = A + B∑π + KΣEvs (R) lg (активность или селективность) = A + B∑π + C(Σπ)2

lg (активность или селективность) = A + B∑π + C(Σπ)2 + DΣEvs (RO) lg (активность или селективность) = A + B∑π + C(Σπ)2 + KΣEvs (R)

2.4. Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)

Кровь и мозг мышей получали от самцов белых аутбредных мышей линии CD1 весом 20-25 г в возрасте 1.5 - 2 месяцев (Пущино, Россия), кровь крыс получали от самцов крыс популяции Wistar весом 160-180 г в возрасте 1.5 месяцев (Пущино, Россия), мозг кур получали от взрослых белых кур породы Леггорн весом 1.5-2 кг в возрасте 18 месяцев (Ногинская птицефабрика,

97

Россия). Содержание животных и все манипуляции осуществляли в соответствии с требованиями комиссии ИФАВ РАН по биоэтике и «Правилами лабораторной практики» (Приказ Минздравсоцразвития России от 23 августа 2010г. № 708н). Животных умерщвляли декапитацией в условиях CO2-анестезии.

Получение 9S фракции гомогената головного мозга мышей и кур.

Головной мозг мышей и кур после декапитации быстро выделяли на холоду, промывали раствором 0.9% (в/об) NaCl, осушали, взвешивали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC. Перед проведением измерений мозг медленно размораживали на льду, гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера (тефлон - стекло) при t = 40C в рабочем буфере (50 мМ трис-HCl, 0.2 мМ ЭДТА, pH 8.0) в соотношении 1г ткани: 5мл буфера. Гомогенат центрифугировали на центрифуге К-24 (Германия) при 4оС в течение 15 мин при 9000×g. Полученный супернатант 9S аликвотировали в пластиковые пробирки Eppendorf, замораживали в жидком азоте и хранили при –70oC до проведения измерений. Концентрация белка в гомогенатах мозга мыши составляла 5.9 -7.6 мг/мл (N=20), в 9S гомогенатах мозга кур 6.9 – 7.2 мг/мл (N=8).

Кровь мышей и крыспосле декапитации собирали в стеклянныестаканчики, которые предварительно ополаскивали 3.8% (в/об) цитратом натрия. Сбор крови крыс проводили в стеклянные стаканчики, содержащие 3.8% цитрата натрия в соотношении 0.2 мл антикоагулянта на 1 мл крови. Для сбора крови мышей в качестве антикоагулянта добавляли гепарин (20 мкл раствора 500 E/мл). Затем кровь аликвотировали в пластиковые пробирки Eppendorf, замораживали в жидком азоте и хранили при –70oC до проведения измерений.

Образцы цельной крови человекаполучали от 9 здоровых добровольцев(женщины в возрасте 30-55 лет), не подвергавшихся воздействию антихолинэстеразных веществ. Забор крови проводили в условиях медицинского стационара с помощью вакуумной системы «Вакуэт» в пробирки с антикоагулянтом (цитрат натрия 3.8% в/об, при соотношении 0.2 мл

98

антикоагулянта на 1 мл крови). Затем кровь аликвотировали, замораживали в жидком азоте и хранили при -70oC до проведения измерений.

Плазму кровиполучали центрифугированием свежих образцов крови при2500×g в течение 15 минут на центрифуге Eppendorf 5702, аликвотировали в пластиковые пробирки, замораживали в жидком азоте и хранили при –70oC до проведения измерений.

Приготовление препаратов гемолизованной крови.Замороженную ихранящуюся при -70ºC кровь оттаивали на водяной бане со льдом. Затем готовили 1:100 гемолизаты путем разбавления 1 объема крови в 100 объемах охлажденного на водяной бане со льдом соответствующего буфера: 0.1 М K-Na-фосфатный буфер pH 7.5 для АХЭ и БХЭ; 0.1 М K-Na-фосфатный буфер pH 8.0, содержащий 2 мМ ЭДТА для КЭ и 0,1 М трис -HCl буфер pH 8.0, содержащий 1 мМ CaCl2 для PON1. После тщательного перемешивания на холоду в течение 2 минут гемолизованную кровь аликвотировали в пластиковые пробирки Falcon, немедленно замораживали в жидком азоте для обеспечения полноты гемолиза и хранили при –20ºC до проведения исследований. Перед началом анализа образцы медленно оттаивали на водяной бане со льдом. Концентрация белка в препаратах цельной крови мышей составляла 11.3-18.7 мг/мл (N=24).

Определение концентрации белкав препаратах тканей проводили пометоду Брэдфорда с использованием сывороточного альбумина в качестве стандарта [461].

Перед определением активностей исследуемых ферментов в тканях мы исследовали зависимость скорости гидролиза соответствующих субстратов от количества плазмы, крови и 9S гомогената мозга в реакционной смеси. Из линейных участков зависимостей были выбраны объемы плазмы, крови и 9S гомогената мозга с достаточной скоростью гидролиза для стандартного определения активности ферментов.

В качестве примера на Рисунке 2.2.-5 приведены зависимости скорости гидролиза АТХ от количества крови мыши и БТХ от количества 9S фракции

99

гомогената мозга мыши.

0.07

АХЭ

0.010

БХЭ

кровь мыши

мозг мыши

0.06

1 мМ АТХ

0.008

1 мМ БТХ

OD/min

0.05

OD/min

0.006

0.04

0.004

0.03

0.02

0.002

0.01

200

400

600

800

1000

0.0000

20

40

60

80

100 120 140

гемолизованная кровь мыши (1:100), мкл

гомогенат мозга мыши, мкл

Рис. 2.2. 5.Зависимость скорости гидролиза (А)-АТХ(1мМ)под действиемАХЭ крови мыши от количества гемолизованной крови (мкл) в реакционной смеси и(Б) – БТХ (1мМ) под действием БХЭ мозга мыши от количества 9S гомогената мозга мыши (мкл) в реакционной смеси.

Аналогичным образом были подобраны количества крови и плазмы человека, мыши и крысы, а также количества 9S фракции гомогената мозга мышей и кур для определения активности всех исследуемых ферментов в стандартных условиях.

2.5. Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови

Спектрофотометрические измерения активности эстераз и PON1 в препаратах тканей проводили на спектрофотометре Gilford-250 (England) в кюветах объемом 3 мл и длиной пути луча 1 см при 25oC. Для всех полученных данных вносилась поправка на спонтанный гидролиз субстрата.

Определение активности АХЭ и БХЭпроводили колориметрическим

методом Эллмана [459] с использованием 1 мM ацетилтиохолина (АТХ) и 1 мM бутирилтиохолина (БТХ) в качестве субстратов, соответственно, в 0.1 M K-Na-фосфатном буфере pH 7.5 при 25oC в присутс твии 0.33 мМ ДТНБ. При определении активности АХЭ в крови использовали специфический ингибитор БХЭ – 0.02 мM этопропазин (10 минутная преинкубация) [128, 135, 462]. Для

100

снижения интерферирующего влияния абсорбции гемоглобина при 412 нм (ε412 = 14150 M-1 × cm-1), длина волны анализа в обоих случаях была изменена на 436 нм (ε436=10600 M-1cm-1) [462]. Количество гемолизованной крови, взятой для анализа, составляло 0.8 - 1 мл.

Определение активности АХЭ и БХЭ в плазме крови и гомогенате

мозгапроводилось при стандартной длине волны